Post on 02-May-2015
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AMPLIFICAZIONE IN AMPLIFICAZIONE IN VITRO DEL DNAVITRO DEL DNA
““REAZIONE A CATENA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASIDELLA POLIMERASI
(PCR)”(PCR)”
• Inventata da Kary Mullis negli anni ‘80 (premio Nobel 1993)
• Serve per ottenere una grande quantita’ di una specifica sequenza di DNA in vitro
• Puo’ amplificare un tratto di DNA per piu’ di 1 milione di volte
PCR: reazione polimerasica a catena
ELEMENTI NECESSARI ALLA REAZIONE:
1- DUE OLIGONUCLEOTIDI COMPLEMENTARI A DUE REGIONI CHE SI TROVANO SU FILAMENTI OPPOSTI DEL DNA STAMPO AI LATI DELLA REGIONE CHE SI VUOLE AMPLIFICARE
2- DNA STAMPO CHE CONTENGA LA REGIONE DA AMPLIFICARE
3- POLIMERASI TERMOSTABILE (NON VIENE DENATURATA SE PORTATA A 95° C)
4- I 4 DESOSSINUCLEOTIDI TRIFOSFATI
IL PROCESSO DI PCR PREVEDE UN CERTO NUMERO DI CICLI. OGNI CICLO CONSISTE DI 3 PASSAGGI:
1- DENATURAZIONE: TEMP. 95°C. IL DNA STAMPOVIENE DENATURATO, I DUE FILAMENTI SI SEPARANO
2-APPAIAMENTO: 55°C CIRCA. I PRIMERS SI APPAIANOCON IL DNA STAMPO
3- SINTESI: TEMP.72°C E’ OTTIMALE PER IL FUNZIONAMENTO DELLA Taq (Termus aquaticus) POLIMERASI
PCR: Reazione a catena della polimerasi
Metodo di amplificazione del DNA usando una polimerasi termostabile quale la Taq DNA polimerasi, uno stampo di DNA, un eccesso di primers e dideossinucleotidi (dNTP) in un buffer.
PCR: Reazione a catena della polimerasi
PCR: Reazione a catena della polimerasi
PCR: amplificazionePCR: amplificazione
n.ro cicli
1
3
10
15
20
25
30
n.ro sequenze bersaglio
0
2
256
8192
262.144
8.388.608
268.435.456
La sequenza bersaglio è la sequenza di DNA sintetizzata tra i due primers
Occorre ~1g di DNA per l’analisi di una sequenza o una digestione con enzimi di restrizione tali da poter essere visibili in elettroforesi. Se vi sono ~5 pg di DNA/cellula umana (5x10 -12g) allora ~1 g of DNA potrebbe essere isolato da 200.000 cellule ma avremmo un miscuglio di tutti i geni.
In 1 g di DNA genomico, una copia singola di un gene (300 bp) equivarrebbe a ~0.1 pg di DNA.
Questo 0.1 pg di DNA potrebbe essere amplificato mediante PCR producendo 0.8 g in 25 cicli e 27 g in 30 cicli.
PCRVANTAGGI:• Sensibilita’• Rapidita’• Si presta all’analisi simultanea di molti campioni (high throughput)• Si presta all’analisi simultanea di diverse sequenze sullo stesso
campione• Si presta all’analisi di DNA degradato o incluso in mezzi strani, o
fissato• SVANTAGGI:• Sensibilita’ (rischio di contaminazioni-falsi positivi)• Variabile efficienza di amplificazione a seconda della sequenza• Richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare e messa
a punto per coppie di oligonucleotidi di innesco (primers)• Può sintetizzare frammenti relativamente corti• La sintesi è imprecisa e introduce errori nella sequenza (la Taq pol
non possiede attività 3’->5’ esonucleasica)
Esempi di utilizzo della PCR
• Su DNA:– segnalare la presenza o meno di sequenze specifiche
(mutazioni, inserzioni virali, micro-organismo patogeni) -> PCR DIAGNOSTICA
– Amplificare frammenti specifici da usare in seguito come sonde oppure da “clonare”
• Su RNA messaggero (RT-PCR):– segnalare la presenza di specifiche molecole di RNA (espressione
genica, presenza di RNA di micro-organismi infettivi)
– Amplificare frammenti specifici da usare in seguito come sonde oppure da “clonare” - isolare cDNA specifici per determinati geni.
PCR/RFLP per l’analisi dell’anemia falciformePCR/RFLP per l’analisi dell’anemia falciforme
PCR/VNTR/STR in genetica forensePCR/VNTR/STR in genetica forense
Quale delle persone sospette può avere commesso il crimine?
La tecnica PCR è utile, spesso necessaria, per amplificare il DNA estratto dai reperti trovati sulla scena del delitto. Si usano sonde multi-locus con molti alleli.
Diagnosi di mutazioni mediante amplificazione allele-specifica
Diagnosi genetica pre-impianto
PCR utilizzata per rivelare uno specifico mRNA:
PCR in seguito a trascrittasi inversa (RT-PCR)
• Estrazione dell’RNA• Purificazione dell’RNA poliadenilato (mRNA)• Sintesi del cDNA con la trascrittasi inversa
AAAAAAAA 3’5’
TTTTTTTT 5’3’
mRNA
cDNA
PCR utilizzata per rivelare uno specifico mRNA:
PCR in seguito a trascrittasi inversa (RT-PCR)
AAAAAAAA 3’5’
TTTTTTTT 5’3’
mRNA
cDNA
• Amplificazione della sequenza di interesse con oligonuceotidi di innesco specifici
5’3’
• Analisi dei prodotti dell’amplificazione (elettroforesi)
TTTTTTTT 5’3’5’ 3’
AAAAAAAA 3’5’
La PCR non e’ una tecnica quantitativa
Nu
mb
er
of
mo
lec
ule
s
Number of cycles
PCR quantitativa: RT-PCR in tempo reale
• Utilizza particolari sostanze la cui fluorescenza si rivela quando intercalano la catena di DNA sintetizzata durante la reazione di amplificazione.
• L’utilizzo di appositi apparecchi permette la misurazione della fluorescenza accumulata in tempo reale, proporzionale al numero di molecole amplificate e quindi al numero di molecole presenti in partenza
Polymerase Chain Reaction: resa• Resa teorica: 2n
P=(2)n T Il prodotto (P) incrementa esponenzialmente con il numero di cicli di PCR (n)
Il prodotto di PCR dipende da T,numero di copie di template di partenza
Lo
g[D
NA
]
N° ciclitermici
EsponenzialeEsponenziale
LineareLinearePlateauPlateau
Prodotto Prodotto variabilevariabile
Polymerase Chain Reaction: plateau
Resa effettiva: effetto plateau
Il processo di duplicazione non procede “all’infinito”, esso è limitato da:
Quantità dei primers
Attività della Taq polimerasi
Reannealing dei filamenti
Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei prodotti
Soluzioni• Utilizzare i dati ottenuti durante la fase esponenziale
Il prodotto di PCR è proporzionale al template iniziale
• Questo è reso possibile mediante il rilevamento, di una fluorescenza, che è proporzionale al prodotto di PCR
• La fluorescenza, durante ogni ciclo di amplificazione, può essere rilevata utilizzando uno strumento quantitativo ma anche dei marcatori fluorescenti il cui accumulo segue la stessa cinetica della reazione di PCR
RT-PCR convenzionaleRT-PCR convenzionale
Manual or Manual or automated automated
analysisanalysis
ReverseReverse transcriptiontranscription
PCRPCR reactionreaction
NestedNestedPCR reactionPCR reaction
GelGelelectrophoresiselectrophoresis
DNADNAsequencingsequencing
Southern Southern blotblot
Real-time RT-PCRReal-time RT-PCR
ReverseReversetranscriptiontranscription
PCR reaction PCR reaction Quantitative Quantitative
resultresult
Perché Real-Time?
Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati rispetto alla PCR tradizionale "end point"
RT-PCR quantitativa
PlotPlot linearelineare
Incremento diIncremento difluorescenzafluorescenza
Cicli di PCR Cicli di PCR
•Rilevamento della fluorescenza associata all’amplificazioneRilevamento della fluorescenza associata all’amplificazione •Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosioIl prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosio
•Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computerAnalisi del prodotto di fluorescenza tramite computer
Analisi tramite software
•La fluorescenza si genera durante la PCR per
effetto di diverse possibili reazioni chimiche
•Le chimiche principali sono basate sia sul
legame di coloranti fluorescenti che si intercalano
nella doppia elica di DNA, come il SYBR Green,
sia sull'ibridazione di sonde specifiche.
Chimiche fluorescenti Chimiche fluorescenti per PCR Real-Timeper PCR Real-Time
SYBR Green
SYBR Green ISYBR Green: principioUtilizza una molecolaUtilizza una molecola fluorescente non specifica che si fluorescente non specifica che si
lega al solco minore del DNAlega al solco minore del DNA
All’inizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione contiene DNA denaturato, primers e la
molecola fluorescente
SYBR GreenSYBR Green
SYBR GreenSYBR GreenDopo l’annealing dei primers, si legano poche molecole fluorescenti alla doppia elica.
SYBR GreenSYBR GreenDurante l’elongazione si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all’ aumento del numero di copie dell’amplicone
SYBR green
• Metodica semplice
Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa
• Non costosa
• Non-specifica
– La molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie eliche, includendo i dimeri di primers
– È necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di prodotti aspecifici