Lezione 2-3 13/X/06

Cosa dobbiamo sapere

La doppia elica: orientamento dei due filamenti 5’-3’ DNA poli cromatidi da cosa sono costituiti ?

quale è il verso di trascrizione della RNA pol II“coding strand”* = filamento trascritto = mRNA * non è il templato

cDNA (DNA complementare al messaggero)

da distinguere dalla Coding Sequence a volte confusa col cDNA

La sequenza codificante corrisponde all’ RNA messaggero contiene i codoni che vengono tradotti

Trascrizione e complemetarietà

In banca dati la sequenza di un gene è indicata nel versodi trascrizione e corrisponde alla coding sequenceche è uguale al messaggero (salvo T U)Le sequenze per convenzione si scricvono sempre 5’3’ salvo quando si mostra una doppia elica in cui c’è la complementare che è antiparallela

Trascrizione orientamento e versoLa sequenza “coding” non è il templato

SBAGLIATO

Quale strand è trascritto? che verso ha ?

Rna polimerasi II

DNA templato della trascrizione Tutte le pol sintetizzani 5’-3’ su un templato 3’- 5’ antiparallelo

schema giusto

Cosa è un Southern blotDNA digerito con enzimi di restrizione - trasferito su filtro- Ibridato con una sonda marcata di DNA a doppio filamento denaturato o con singolo filamento

Studio di mappe di restrizione genomiche per individuare i frammenti di restrizione che contengono una data porzione di DNA o un frammento di un gene,

Studio di un gene a partire da un cDNA

Gel BrEt x Southern

Foto SouthernA: Genomic P1 clone (0.3 ug) and B: human genomic DNA (10 ug) were digested with EcoRI (E), BamHI (B), HindIII (H) and PstI (P). The digested samples were separated on a 1% agarose TBE gel, blotted and hybridized with a PEDF cDNA probe. A 1 kb ladder is given to show relative sizes of the hybridizing bands. The figure shows similarities in restriction pattern between the genomic DNA and the P1 clone.

Cosa si analizza con un Northern blot La trascrizione cellulare

Foto Northern (lattato deidrogenasi)

Le sonde (probes)

Sonde a DNA doppio o singolo filamento anche ad RNA**

Sonde clonate o amplificate

Plasmidi con promotore di trascrizione Sp6**

Sonde marcate (32 P) o fluorescenti

Southern o Northern tipi di sonde uguali

Per Northern uso di sequenze trascritte

Dall’espressione al genomae viceversa

Con le sonde dei cDNA al genoma (mappa e regioni non trascritte)

Con le sonde genomiche ricerca di geni

Uso dei marcatoriRicerche di tutte le sequenze trascritte come marcatori

Da sequenze ripetute mappature cromosomiche

Struttura e regolazione dei geni

Perché i geni sono regolati

Meccanismi di regolazione dei geni

Differenze tra procarioti ed eucarioti

Differenti strutture regolative analizzate con geni reporter e utilizzate all’interno di plasmidi

e vettori per espressione

Dovete sapere come è strutturato un gene, differenze tra procarioti ed eucarioti, geni costitutivi e “house keeping”, geni inducibili, regolati e tessuto specifici. (corso di bio molec.)

Che vuol dire clonare a che serve come si fa

I cloni in microbiologia o genetica dei microoranismi

I colonia (clone) deriva dalle mitosi di una singola cellulae contiene qualche centinaio di migliaia di cellule

Cloni di cellule eucariotiche

Esperimenti olistici (≠ progr. euristici autoincr.)

Phenotypic alteration of eukaryotic cells using randomized libraries of artificial transcription factors Nature Biotechnology 21, 1208 - 1214 (2003)Published online: 7 September 2003; | doi:10.1038/nbt868Kyung-Soon Park1, 2, Dong-ki Lee1, 2, Horim Lee1, Yangsoon Lee1, Young-Soon Jang1, Yong Ha Kim1, Hyo-Young Yang1, Sung-Il Lee1, Wongi Seol1 & Jin-Soo Kim1Correspondence should be addressed to Jin-Soo Kim jsk@toolgen.com

We have developed a method in which randomized libraries of zinc finger−containing artificial transcription factors are used to induce phenotypic variations in yeast and mammalian cells. By linking multiple zinc-finger domains together, we constructed more than 100,000 zinc-finger proteins with diverse DNA-binding specificities and fused each of them to either a transcription activation or repression domain. The resulting transcriptional regulatory proteins were expressed individually in cells, and the transfected cells were screened for various phenotypic changes, such as drug resistance, thermotolerance or osmotolerance in yeast, and differentiation in mammalian cells. Genes associated with the selected phenotypes were also identified. Our results show that randomized libraries of artificial transcription factors are useful tools for functional genomics and phenotypic engineering.

Clonaggio come manipolazione di DNA

Clonaggio : plasmidi enzimi di restrizione

Clonaggio perché i cloni sono isogenici e se contengono un plasmide si moltiplica con le cellule

Le cellule trasfettate col plasmide si clonano

Strategia e metodo di clonaggio

Extraction of Viral RNA and Conversion to DNA

RNA

Reverse Transcription

DNA

Cloning a Gene into a Plasmid

PCR

DNA encodinggene of interest

Cloning

pl plasmid

Amplificazione tramite PCR

Gene codificante di interesse

clonaggio

Plasmide di espressione

Growth and Purification of Plasmids

Plasmid growthin bacteria Purification of

plasmid

ExtractionTransfectiontrasfezione

crescita batterica col plasmidetramite selezione

estrazione del DNA

Purificazione del plasmide

Recombinant DNA Technology and Vaccine Development

CHO, yeast,or insect cells

In vitro antigenproduction

In vivoantigen

production

Vaccine vector

Cellule eucariotiche

produzione dell’antigeneIn vitro

vettorecol vaccino

Produzione dell’antigene in vivo