Metodi di sequenziamento

•Sanger (enzimatico)

•Maxam e Gilbert

(chimico)

Metodo di Sanger

primer

primernuovo DNA

dideossinucleotideterminatore

quattro dNTP (incluso 32PdNTP)DNA polimerasi

La catena neosintetizzata termina quando un ddNTP è incorporato al posto di un dNTP

Denaturare e separare su gel di poliacrilammide

ddTTP ddCTP ddGTP ddATP

Metodo di Maxam e GilbertDNA singolo filamento marcato ad una estremità

4 o 5 reazioni di modificazione base-specifiche

Rottura del filamento in corrispondenza della base modificata mediante piperidina

Es. metilazione delle G con dimetilsolfato

Separare i frammenti marcati su gel di acrilammide

Gel di poliacrilammide di sequenza

Confronto metodi di sequenziamento

Sanger

rapida e semplice attuazione

disponibilità di kit

necessità di primer

sensibile a strutture secondarie

Maxam e Gilbert

lunga preparazione del DNA

reazioni da mettere a punto

relativamente economico

strutture non influenti

utilizzabile per oligonucleotidi

Sequenziamento automatico

Sequenziamento con Taq polimerasi

Trasferimento di acidi nucleici(Blotting)

•Southern

•Northern

Schema trasferimento

Schema ibridazione

Metodi di trasferimento

•Capillare

•Elettroblot

carta 3MM

membrana nylon

gel

supporto

}

carta 3MM

tamponevaschetta

Assemblaggio del blot capillare

- +

tampone

carta 3MM

spugnettegel

membrana nylon

Assemblaggio dell’elettroblot

Analisi di espressione con Northern blot

Altre tecniche di analisi

•Estensione del primer (primer extension)

•Protezione dalla S1/RNasi

(mapping)

•RT-PCR

mRNA totale

oligo antisenso marcato

mRNA globina

cap

5’3’

ibridazione

estensione con RT

Analisi dei frammenti estesi su gel di sequenza

frammento protetto

Estensione del primer

Protezione da RNasi (RNase Protection)

mRNA totale

sonda RNA antisenso

mRNA globina

cap

5’3’

ibridazione

trattamento con RNasi

Analisi dei frammenti protetti su gel di sequenza

frammento protetto

inizio trascrizione

Analisi interazioni DNA-proteine:saggio di footprinting

Analisi interazioni DNA-proteine:saggio EMSA

Sistemi di espressione

•In vitro (estratti cellulari)

•In vivo (cellule in coltura)

•Animali transgenici

Gene reporter

•diversi tipi di vettori

•vettori “navetta” batteri-lievito

•possibilità di ricombinazione omologa

Trasformazione del lievito (Saccharomyces

cerevisiae)

Vettori di clonaggio

per lievito

Ricombinazione omologa

•transiente

•stabile

•vettori episomali

Trasfezione di cellule in coltura

Vettore di espressione in cellule di mammifero

Trasfezione in cellule in coltura

Vettori episomali

•fosfato di calcio

•liposomi (e simili)

•elettroporazione

•virus (SV40, retrovirus)

Metodi di trasfezione

Descrizione generale esercitazioni di laboratorio

Studio della localizzazione intracellulare della proteina SEC4 del lievito Saccaromyces cerevisiae

A) Clonaggio di SEC4 in vettore per l'espressione in lievito di proteine di fusione con "tag" (GFP)

B) Espressione di SEC4 in lievito e analisi della sua localizzazione mediante western

blot di estratti frazionati

Parte A

1) Isolamento di DNA genomico da lievito (I parte)

2) Isolamento di DNA genomico da lievito (II parte)Analisi spettrofotometrica del DNA preparato PCR su DNA genomico (preparazione frammento da clonare)

3) Preparazione di DNA plasmidico (vettore di clonaggio) con colonninaDigestione DNA (vettore e frammento) con enzimi di restrizione

4) Analisi su gel di agarosioReazione con enzima "ligasi"

5) Preparazione piastre di agarTrasformazione batterica

6) Analisi risultati trasformazioneMinipreparazione DNA plasmidico

7) Analisi su gel di agarosio

8) Fasi iniziali di Southern blot

Clonaggio con doppia digestione

GAATTCCTTAAG

GAATTCCTTAAG

AAGCTTTTCGAA

GCTTAA

AGCTT A

EcoRI

AAGCTT

TTCGAAGAATTC

CTTAAG

DNA ligasi

AATTC G

ATTCGA

EcoRI HindIII

AAGCTTTTCGAA

HindIII

Trasfezione con liposomi

Elettroporazione

Vettori virali

Vettori retrovirali