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Trasduzione dei segnali del TCR

Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016

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TCR: trasduzione del segnale


• I segnali trasdotti dal TCR inducono l’espressione coordinata di numerosi geni (silenti nelle cellule naive)– proliferazione– differenziamento– funzioni effettrici

• La trasduzione del segnale è indotta dalla stimolazione di più recettori TCR (tutti con la stessa specificità antigenica) e corecettori

• Il risultato del riconoscimento dell’antigene è determinato dalla durata e dall’affinità dell’interazione tra TCR e complesso peptide-MHC

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Gli eventi precoci in risposta al riconoscimento dell’antigene comportano il raggruppamento di diversi recettori di

membrana, la fosforilazione in tirosina di numerose proteine e il reclutamento di molecole adattatrici


I segnali indotti dal recettore per l’antigene attivano diverse vie di trasduzione


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Eventi di trasduzione del segnale• attivazione tirosine chinasi/fosfatasi• coinvolgimento di molecole adattatrici• generazione di secondi messaggeri

– DAG, IP3, Ca2+, cAMP, cGMP• amplificazione attraverso cascate di enzimi• attivazione di serina/treonina chinasi/fosfatasi• attivazione di fattori di trascrizione• attivazione trascrizione di geni


• TCR ha una bassa affinità per complessi MHC-peptide– Kd 10-5-10-7 M– Off rate veloce

• Singoli TCR inducono un segnale debole• Poche delle molecole MHC espresse da APC presentano peptide riconoscibile da un determinato TCR • Solo 10-100 complessi MHC-peptide (in un totale di 104-105) necessitano di essere riconosciuti da TCR per indurre attivazione• Lo stesso TCR può essere attivato più volte • L’intero processo può durare ore

TCR: trasduzione del segnale


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• Questa prolungata interazione è permessa dalla costituzione della SINAPSI IMMUNOLOGICA nell’area di contatto tra cellula T e APC• Il raggruppamento di raft è un evento necessario per la formazione della sinapsi immunologica• A seguito di stimolazione TCR monomerici vengono reclutati in raft e formano dei cluster• Anche molecole adattatrici e di trasduzione del segnale sono reclutate nei raft (ZAP70, Vav, Grb2)

“Sinapsi Immunologica”

Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016(IS: immunological synapse, sinapsi immunologica)

I raft• I raft sono strutture lipidiche organizzate, ricche in lipidi saturi, colesterolo e GM1• Compartimentalizzano molecole importanti per la trasduzione del segnale

– che sono reclutate nei raft attraverso modifiche post-traduzionali• aggiunta di acido miristico: p56lck e p59fyn• aggiunta di acido palmitico: p56lck, LAT e PLCg1, H-Ras

• L’integrità dei raft è richiesta per trasdurre segnali indotti da TCR• In risposta a TCR/CD28 i raft muovono all’ISUniversità di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016

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I raft• I raft sono strutture lipidiche organizzate, ricche in lipidi saturi, colesterolo e GM1• Compartimentalizzano molecole importanti per la trasduzione del segnale

– che sono reclutate nei raft attraverso modifiche post-traduzionali• aggiunta di acido miristico: p56lck e p59fyn• aggiunta di acido palmitico: p56lck, LAT e PLCg1, H-Ras

• L’integrità dei raft è richiesta per trasdurre segnali indotti da TCR• In risposta a TCR/CD28 i raft muovono all’ISUniversità di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016

Linfocita T non stimolato

Stimolazione TCR

Stimolazione TCR e CD28

La stimolazione di TCR e CD28 polarizza i raft verso il sito di contatto

La stimolazione di TCR e CD28 polarizza i raft verso il sito di contatto


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• Inizialmente cellula T e APC interagiscono attraverso molecole di adesione– LFA-1 ICAM

• In questa fase il TCR controlla complessi MHC-peptide– se non riconosce complessi, l’interazione cellula T-APC cessa

• Se il TCR riconosce complessi MHC-peptide invia segnale:– aumento affinità LFA-1 → stabilizzazione interazione– arresto migrazione (segnale di stop), ritiro uropode

• meccanismo che ritiene cellule T in organi linfatici secondari

Sinapsi Immunologica (3)


Ruolo di integrine e TCR ininterazione cellule T - APCRuolo di integrine e TCR ininterazione cellule T - APC

TCR non riconoscecomplesso Ag-MHC

DissociazioneAPC cellula T

TCR riconosceComplesso Ag-MHC

Forte adesioneAPC cellula T Risposta

funzionale

Adesione deboleIndipendente da Ag


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• Stimolazione di TCR e LFA-1 induce la polarizzazione della cellula T in direzione della APC (antigen-presenting cell)• Riorganizzazione citoscheletro

– filamenti di actina e talina sono reclutati nei pressi della sinapsi imm.– MTOC (MicroTubule Organising Center) si sposta dall’uropode a IS– questi eventi favoriscono il reclutamento di recettori e molecole di trasduzione alla sinapsi immunologica

• LFA-1 migra verso la porzione esterna dello SMAC mentre i TCR muovono al centro– il blocco nella formazione di questo cluster centrale blocca l’attivazione dei linfociti T

• La riorganizzazione è in parte condizionata dalle dimensioni dei complessi recettori-ligandi

Sinapsi Immunologica (4)


MHC B7 ICAMCD58ICAM

CD2 TCR CD28LFA-1 LFA-1

15 nm

Linfocita T

APCUniversità di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016

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Supra-Molecular Activation ClusterLFA-1 TCR

cSMAC

pSMAC

OverlayCD28


A seguito di attivazionePKCq è reclutata nella IS

A seguito di attivazioneCD45 non è reclutata nella IS


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Complesso del TCR


• CD3– catene g, d, e

• omologhe l’una con l’altra• singolo dominio Ig

– 1 eterodimero d/e– 1 eterodimero g/e

• catena z– omodimero z/z

• in 90% CD3– eterodimero z/h

• in 10% CD3• h splicing alternativo z

– le catene z sono associate anche ad altri recettori

• durante la maturazione dei timociti le proteine del CD3 e z sono espresse prima del TCR ma saranno presenti sulla membrana cellulare solo dopo il corretto assemblaggio con le catene a/b del TCR

Immunoreceptor Tyrosine-based Activation MotifITAM


• ITAM: Tyr-x-x-Leuxxxxxx(xx)Tyr-x-x-Leu– 1 ITAM in catene g, d, e– 3 ITAM in catene z

• Le sequenze ITAM di CD3/catene z collegano funzionalmente riconoscimento dell’antigene da parte del TCR e trasduzione del segnale

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ITAM

• La fosforilazione delle ITAM del CD3 e delle catene z avviene pochi secondi dopo la stimolazione del TCR• Due famiglie di PTK fosforilano e interagiscono con le ITAM – Src e Syk• Inibitori delle PTK inibiscono gli effetti della stimolazione del TCR


TCR CD4

Membrana cellularelinfocita T

Membrana cellulareAPC

Il corecettore CD4• Composto da 1 catena• 4 domini Ig extracellulari• riconosce dominio b2 di MHC II• CD4 lega p56lck in porzione intracitoplasmatica• Topi KO per CD4 non hanno linfociti T ristretti da MHC II

– se transfettati con CD4 normale sviluppano linfociti T ristretti da MHC II– se transfettati con CD4 privo del sito di legame per p56lck mancano di linfociti T ristretti da MHC II

• Espresso da timociti, linfociti Tab periferici (ca. 65%), alcune cellule dendritiche

MHC II


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Il corecettore CD8• Composto da 2 catene legate da ponte disolfuro

– eterodimero CD8a/CD8b– omodimero CD8a/CD8a

• 1 dominio Ig extracellulare/catena• riconosce dominio a3 di MHC I

• CD8 lega p56lck in porzione intracitoplasmatica• Topi KO per CD8 non hanno linfociti T ristretti da MHC I


La Src chinasi p56lck

• “Unique”, sequenza caratteristica della famiglia– lega CD4 e CD8

• SH3, lega sequenze specifiche ricche in prolina• SH2, lega P-Tyr all’interno di specifiche sequenze• Kinase, dominio catalitico• R, dominio regolatorio

N-terminale C-terminaleUnique SH3 SH2 Kinase R

Y Y


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Dominio SH2• SH2, Src Homology 2• Dominio proteico

strutturalmente conservatocontenuto in Src ed altreproteine che trasduconosegnali

• SH2 lega residui di Tyr fosforilati nel contesto di specifiche sequenzepeptidiche

NH2

COOH

Dominio SH2 di p56 LckUniversità di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016

L’attività catalitica di Lck è regolata da cambiamenti conformazionali

• Fosforilazione di Y in dominio catalitico induce cambiamento conformazionale che permette accesso del substrato• La fosforilazione della Tyr nel dominio regolatorio induce una conformazione chiusa– SH2 interagisce con il C-terminale

SH3SH2

Dominio cataliticoDominio regolatorioYYP

YY PYStimolazione TCR

PTPase

CD45

Csk


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La Syk chinasi ZAP-70N-terminale C-terminale

493292

SH2 KinaseSH2Y Y


• z chain-associated protein 70• Espressa esclusivamente in linfociti T e NK• 2 domini SH2 legano ITAM fosforilate con affinità elevata• La fosforilazione di Y292 ad opera della stessa ZAP-70 inibisce l’attività catalitica

– autoregolazione negativa• La fosforilazione di Y493 nel dominio catalitico attiva l’enzima

– Y493 fosforilata da p56lck

ZAP

CD4MHCII-Ag

TCRCD3

zz

TCR

CD3

CD4


• ZAP-70 si lega alle ITAM fosforilate attraverso 2 domini SH2• p56lck fosforila le ITAM di CD3 e z

• p56lck fosforila Y493 di ZAP-70

• CD4 avvicina Lck a TCR-CD3• MHCII-Ag, TCR e CD4 interagiscono

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LAT, Linker for Activation of T cells (1)• Molecola adattatrice che permette di reclutare enzimi e altri adattatori• Permette l’attivazione di almeno3 vie di trasduzione

– Ras Raf Mek Erk Elk Fos– SLP76 Vav Rac Mekk JNK Jun – PLCg1

• IP3 Ca2+• DAG PKC

• Localizzato nei raft attraverso modifica post-traduzionale (palmitoilazione) • Viene fosforilato da ZAP70Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016

• In assenza di LAT molti degli eventi indotti dalla trasduzione del segnale del TCR sono compromessi:– flusso di calcio– attivazione ERK e altre MAP chinasi– attivazione di fattori trascrizione (NF-AT, AP-1)– produzione IL-2

• LAT è richiesto anche per lo sviluppo dei linfociti T nel timo• Topi LATKO non producono cellule T mature

LAT, Linker for Activation of T cells (2)


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CD3

abTCR CD4

PIP2DG

IP3

LAT

PKCq

PLC

LAT PLCg1

lckZAP


ZAPlckCD3

abTCR

PLC

CD4

PIP2 DG

IP3

LAT

Ca2+

PKCq

CRAC

Ca2+Ca2+Ca2+Ras

Attivazione fattori

trascrizione

LATPLCg1Ca2+


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L’aumento di Ca2+ libero intracitoplasmatico è transiente


CD3

abTCR CD4

LATlck

ZAP

LATSOSRasMAP chinasi

Grb2SosShc

RafMEK

ERK Attivazione fattori

trascrizioneUniversità di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016

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CD3

abTCR CD4

LAT

PLC

lckZAP

vav

CD28LAT SLP76 VAV

Attivazione fattori

trascrizioneUniversità di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016

Attivazione fattori di trascrizione• De novo sintesi

– c-Fos• componente di AP-1• trascrizione indotta da stimolazione TCR

• Assemblaggio– dimerizzazione STAT

• fosforilazione da parte di Jak• Modificazioni covalenti• Localizzazione


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Attivazione di fattori trascrizione


Cinetica di espressione in linfociti stimolati da antigene


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• Geni immediati• c-fos, c-jun, nf-at, c-myc, nf-kb < 30’

• Geni precoci• IFNg < 1h• IL-3, IL-2Ra 1-2 h• IL-6 4-6 h• GM-CSF 20 h

• Geni tardivi• VLA-4 4 g• VLA-1, VLA-2, VLA-3, VLA-5 7-14 g

Geni espressi dopo attivazione


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