1
Trasduzione dei segnali del TCR
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
ATTENZIONE: questi file compresi testo ed immagini in essi contenuti sono destinati esclusivaemnte agli studenti del corso per favorirne lo
studio. Nessun file, che potrebbe contenere materiale soggetto a copyright, può essere utlizzato per altri fini senza autorizzazione
TCR: trasduzione del segnale
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
• I segnali trasdotti dal TCR inducono l’espressione coordinata di numerosi geni (silenti nelle cellule naive)– proliferazione– differenziamento– funzioni effettrici
• La trasduzione del segnale è indotta dalla stimolazione di più recettori TCR (tutti con la stessa specificità antigenica) e corecettori
• Il risultato del riconoscimento dell’antigene è determinato dalla durata e dall’affinità dell’interazione tra TCR e complesso peptide-MHC
2
Gli eventi precoci in risposta al riconoscimento dell’antigene comportano il raggruppamento di diversi recettori di
membrana, la fosforilazione in tirosina di numerose proteine e il reclutamento di molecole adattatrici
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
I segnali indotti dal recettore per l’antigene attivano diverse vie di trasduzione
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
3
Eventi di trasduzione del segnale• attivazione tirosine chinasi/fosfatasi• coinvolgimento di molecole adattatrici• generazione di secondi messaggeri
– DAG, IP3, Ca2+, cAMP, cGMP• amplificazione attraverso cascate di enzimi• attivazione di serina/treonina chinasi/fosfatasi• attivazione di fattori di trascrizione• attivazione trascrizione di geni
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
• TCR ha una bassa affinità per complessi MHC-peptide– Kd 10-5-10-7 M– Off rate veloce
• Singoli TCR inducono un segnale debole• Poche delle molecole MHC espresse da APC presentano peptide riconoscibile da un determinato TCR • Solo 10-100 complessi MHC-peptide (in un totale di 104-105) necessitano di essere riconosciuti da TCR per indurre attivazione• Lo stesso TCR può essere attivato più volte • L’intero processo può durare ore
TCR: trasduzione del segnale
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
4
• Questa prolungata interazione è permessa dalla costituzione della SINAPSI IMMUNOLOGICA nell’area di contatto tra cellula T e APC• Il raggruppamento di raft è un evento necessario per la formazione della sinapsi immunologica• A seguito di stimolazione TCR monomerici vengono reclutati in raft e formano dei cluster• Anche molecole adattatrici e di trasduzione del segnale sono reclutate nei raft (ZAP70, Vav, Grb2)
“Sinapsi Immunologica”
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016(IS: immunological synapse, sinapsi immunologica)
I raft• I raft sono strutture lipidiche organizzate, ricche in lipidi saturi, colesterolo e GM1• Compartimentalizzano molecole importanti per la trasduzione del segnale
– che sono reclutate nei raft attraverso modifiche post-traduzionali• aggiunta di acido miristico: p56lck e p59fyn• aggiunta di acido palmitico: p56lck, LAT e PLCg1, H-Ras
• L’integrità dei raft è richiesta per trasdurre segnali indotti da TCR• In risposta a TCR/CD28 i raft muovono all’ISUniversità di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
5
I raft• I raft sono strutture lipidiche organizzate, ricche in lipidi saturi, colesterolo e GM1• Compartimentalizzano molecole importanti per la trasduzione del segnale
– che sono reclutate nei raft attraverso modifiche post-traduzionali• aggiunta di acido miristico: p56lck e p59fyn• aggiunta di acido palmitico: p56lck, LAT e PLCg1, H-Ras
• L’integrità dei raft è richiesta per trasdurre segnali indotti da TCR• In risposta a TCR/CD28 i raft muovono all’ISUniversità di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
Linfocita T non stimolato
Stimolazione TCR
Stimolazione TCR e CD28
La stimolazione di TCR e CD28 polarizza i raft verso il sito di contatto
La stimolazione di TCR e CD28 polarizza i raft verso il sito di contatto
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
6
• Inizialmente cellula T e APC interagiscono attraverso molecole di adesione– LFA-1 ICAM
• In questa fase il TCR controlla complessi MHC-peptide– se non riconosce complessi, l’interazione cellula T-APC cessa
• Se il TCR riconosce complessi MHC-peptide invia segnale:– aumento affinità LFA-1 → stabilizzazione interazione– arresto migrazione (segnale di stop), ritiro uropode
• meccanismo che ritiene cellule T in organi linfatici secondari
Sinapsi Immunologica (3)
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
Ruolo di integrine e TCR ininterazione cellule T - APCRuolo di integrine e TCR ininterazione cellule T - APC
TCR non riconoscecomplesso Ag-MHC
DissociazioneAPC cellula T
TCR riconosceComplesso Ag-MHC
Forte adesioneAPC cellula T Risposta
funzionale
Adesione deboleIndipendente da Ag
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
7
• Stimolazione di TCR e LFA-1 induce la polarizzazione della cellula T in direzione della APC (antigen-presenting cell)• Riorganizzazione citoscheletro
– filamenti di actina e talina sono reclutati nei pressi della sinapsi imm.– MTOC (MicroTubule Organising Center) si sposta dall’uropode a IS– questi eventi favoriscono il reclutamento di recettori e molecole di trasduzione alla sinapsi immunologica
• LFA-1 migra verso la porzione esterna dello SMAC mentre i TCR muovono al centro– il blocco nella formazione di questo cluster centrale blocca l’attivazione dei linfociti T
• La riorganizzazione è in parte condizionata dalle dimensioni dei complessi recettori-ligandi
Sinapsi Immunologica (4)
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
MHC B7 ICAMCD58ICAM
CD2 TCR CD28LFA-1 LFA-1
15 nm
Linfocita T
APCUniversità di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
8
Supra-Molecular Activation ClusterLFA-1 TCR
cSMAC
pSMAC
OverlayCD28
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
A seguito di attivazionePKCq è reclutata nella IS
A seguito di attivazioneCD45 non è reclutata nella IS
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
9
Complesso del TCR
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
• CD3– catene g, d, e
• omologhe l’una con l’altra• singolo dominio Ig
– 1 eterodimero d/e– 1 eterodimero g/e
• catena z– omodimero z/z
• in 90% CD3– eterodimero z/h
• in 10% CD3• h splicing alternativo z
– le catene z sono associate anche ad altri recettori
• durante la maturazione dei timociti le proteine del CD3 e z sono espresse prima del TCR ma saranno presenti sulla membrana cellulare solo dopo il corretto assemblaggio con le catene a/b del TCR
Immunoreceptor Tyrosine-based Activation MotifITAM
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
• ITAM: Tyr-x-x-Leuxxxxxx(xx)Tyr-x-x-Leu– 1 ITAM in catene g, d, e– 3 ITAM in catene z
• Le sequenze ITAM di CD3/catene z collegano funzionalmente riconoscimento dell’antigene da parte del TCR e trasduzione del segnale
10
ITAM
• La fosforilazione delle ITAM del CD3 e delle catene z avviene pochi secondi dopo la stimolazione del TCR• Due famiglie di PTK fosforilano e interagiscono con le ITAM – Src e Syk• Inibitori delle PTK inibiscono gli effetti della stimolazione del TCR
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
TCR CD4
Membrana cellularelinfocita T
Membrana cellulareAPC
Il corecettore CD4• Composto da 1 catena• 4 domini Ig extracellulari• riconosce dominio b2 di MHC II• CD4 lega p56lck in porzione intracitoplasmatica• Topi KO per CD4 non hanno linfociti T ristretti da MHC II
– se transfettati con CD4 normale sviluppano linfociti T ristretti da MHC II– se transfettati con CD4 privo del sito di legame per p56lck mancano di linfociti T ristretti da MHC II
• Espresso da timociti, linfociti Tab periferici (ca. 65%), alcune cellule dendritiche
MHC II
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
11
Il corecettore CD8• Composto da 2 catene legate da ponte disolfuro
– eterodimero CD8a/CD8b– omodimero CD8a/CD8a
• 1 dominio Ig extracellulare/catena• riconosce dominio a3 di MHC I
• CD8 lega p56lck in porzione intracitoplasmatica• Topi KO per CD8 non hanno linfociti T ristretti da MHC I
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
La Src chinasi p56lck
• “Unique”, sequenza caratteristica della famiglia– lega CD4 e CD8
• SH3, lega sequenze specifiche ricche in prolina• SH2, lega P-Tyr all’interno di specifiche sequenze• Kinase, dominio catalitico• R, dominio regolatorio
N-terminale C-terminaleUnique SH3 SH2 Kinase R
Y Y
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
12
Dominio SH2• SH2, Src Homology 2• Dominio proteico
strutturalmente conservatocontenuto in Src ed altreproteine che trasduconosegnali
• SH2 lega residui di Tyr fosforilati nel contesto di specifiche sequenzepeptidiche
NH2
COOH
Dominio SH2 di p56 LckUniversità di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
L’attività catalitica di Lck è regolata da cambiamenti conformazionali
• Fosforilazione di Y in dominio catalitico induce cambiamento conformazionale che permette accesso del substrato• La fosforilazione della Tyr nel dominio regolatorio induce una conformazione chiusa– SH2 interagisce con il C-terminale
SH3SH2
Dominio cataliticoDominio regolatorioYYP
YY PYStimolazione TCR
PTPase
CD45
Csk
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
13
La Syk chinasi ZAP-70N-terminale C-terminale
493292
SH2 KinaseSH2Y Y
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
• z chain-associated protein 70• Espressa esclusivamente in linfociti T e NK• 2 domini SH2 legano ITAM fosforilate con affinità elevata• La fosforilazione di Y292 ad opera della stessa ZAP-70 inibisce l’attività catalitica
– autoregolazione negativa• La fosforilazione di Y493 nel dominio catalitico attiva l’enzima
– Y493 fosforilata da p56lck
ZAP
CD4MHCII-Ag
TCRCD3
zz
TCR
CD3
CD4
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
• ZAP-70 si lega alle ITAM fosforilate attraverso 2 domini SH2• p56lck fosforila le ITAM di CD3 e z
• p56lck fosforila Y493 di ZAP-70
• CD4 avvicina Lck a TCR-CD3• MHCII-Ag, TCR e CD4 interagiscono
14
LAT, Linker for Activation of T cells (1)• Molecola adattatrice che permette di reclutare enzimi e altri adattatori• Permette l’attivazione di almeno3 vie di trasduzione
– Ras Raf Mek Erk Elk Fos– SLP76 Vav Rac Mekk JNK Jun – PLCg1
• IP3 Ca2+• DAG PKC
• Localizzato nei raft attraverso modifica post-traduzionale (palmitoilazione) • Viene fosforilato da ZAP70Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
• In assenza di LAT molti degli eventi indotti dalla trasduzione del segnale del TCR sono compromessi:– flusso di calcio– attivazione ERK e altre MAP chinasi– attivazione di fattori trascrizione (NF-AT, AP-1)– produzione IL-2
• LAT è richiesto anche per lo sviluppo dei linfociti T nel timo• Topi LATKO non producono cellule T mature
LAT, Linker for Activation of T cells (2)
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
15
CD3
abTCR CD4
PIP2DG
IP3
LAT
PKCq
PLC
LAT PLCg1
lckZAP
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
ZAPlckCD3
abTCR
PLC
CD4
PIP2 DG
IP3
LAT
Ca2+
PKCq
CRAC
Ca2+Ca2+Ca2+Ras
Attivazione fattori
trascrizione
LATPLCg1Ca2+
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
16
L’aumento di Ca2+ libero intracitoplasmatico è transiente
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
CD3
abTCR CD4
LATlck
ZAP
LATSOSRasMAP chinasi
Grb2SosShc
RafMEK
ERK Attivazione fattori
trascrizioneUniversità di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
17
CD3
abTCR CD4
LAT
PLC
lckZAP
vav
CD28LAT SLP76 VAV
Attivazione fattori
trascrizioneUniversità di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
Attivazione fattori di trascrizione• De novo sintesi
– c-Fos• componente di AP-1• trascrizione indotta da stimolazione TCR
• Assemblaggio– dimerizzazione STAT
• fosforilazione da parte di Jak• Modificazioni covalenti• Localizzazione
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
18
Attivazione di fattori trascrizione
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
Cinetica di espressione in linfociti stimolati da antigene
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016
19
• Geni immediati• c-fos, c-jun, nf-at, c-myc, nf-kb < 30’
• Geni precoci• IFNg < 1h• IL-3, IL-2Ra 1-2 h• IL-6 4-6 h• GM-CSF 20 h
• Geni tardivi• VLA-4 4 g• VLA-1, VLA-2, VLA-3, VLA-5 7-14 g
Geni espressi dopo attivazione
Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016