Date post: | 01-May-2015 |
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BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE
LEZIONE 16Acidi nucleici e nuovi farmaci I
CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO
Valeria Benedusi
Nuovi target farmacologici: GLI ACIDI NUCLEICI
Duplicazione
DNA duplicato
DNA RNA
Trascrizione
Maturazione
Metabolismo
Traduzione
PROTEINA
FARMACI TRADIZIONALI
VANTAGGI NELL’UTILIZZO DI FARMACI
ANTI-ACIDI NUCLEICI
A- BERSAGLIO MOLECOLARE PIU’ DEFINITO
Numero di proteine intracellulari: 1000-100000
Numero di RNA: 100-10000
Numero di geni: 1-2
B- SINTESI MIRATA
Bersagli possono essere sequenze anche uniche nel genoma
C- AZIONE MOLTO SPECIFICA
Utilizzando interazioni con altri nucleotidi si possono
sfruttare i vantaggi della complementarità tra due catene
secondo il modello di Watson e Crick
ACIDI NUCLEICI COME TERAPEUTICI
1. ANTISENSO: desossinucleotidi complementari con l’m-
RNA
2. ANTIGENE: desossinucleotidi complementari al DNA
3. RIBOZIMA: ribonucleotidi catalitici complementari a RNA
4. APTAMERI: desossi e ribonucleotidi complementari a una
sequenza aminoacidica (competono con l’RNA
nell’interazione tra RNA e proteina)
5. DECOY: DNA complementare a sequenze aminoacidiche
(competono con sequenze di DNA nell’interazione DNA-
proteina)
6. siRNA: RNA complementari a sequenze specifiche
CRONOLOGIA DELL’ANTISENSO
1957
1965
1978
1982
1989
1990
1990
1993
1994
1998
oggi
Tripla elica in vitro (cell-free)
RNA antisenso in batteri
ODN antisenso
RNA catalitico (ribozima)
Recettore per ODN
Tripla elica in vivo (cellule)
Farmacotossicologia ODN in animali
Terapia dell’HBV nell’anatra
Sperimentazione ODN nell’uomo
FOMIVIRSEN è il primo ODN approvato per il trattamento della retinite da Citomegalovirus in pazienti con AIDS
aODN di seconda e terza generazione
GLI OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO (aODN)
A
C
AUCGAUGAG CU G
TAGCTA
… … … … … … …
aODN
mRNA
L’aODN si lega in modo specifico alla sequenza
complementare dell’mRNA. Il tratto di catena ibrida che
così si forma determina per via enzimatica o per
impedimento sterico l’inattivazione dell’intero
messaggero
MECCANISMO D’AZIONE DEGLI aODN
A- ATTIVAZIONE DA PARTE DELLA RNAsi H:
Degrada la componente di RNA delle catene ibride DNA-RNA
B- IMPEDIMENTO STERICO:
La catena di RNA-DNA impedisce la traduzione sui ribosomi, impedendo la sintesi della proteina
aODN
A BRNAsi H
NO PROTEINA
Ribosoma
NO PROTEINA
REQUISITI PER L’ATTIVITA’ DI UNA MOLECOLA ANTISENSO
7
1
2
3
4
5
6
Legarsi a siti accessibili dell’mRNA target
Stabilità
Legame alla cellula ed entrata
Accumulo all’interno della cellula
Evitare la compartimentalizzazione errata
Localizzarsi in siti attivi (nucleo o citoplasma)
nucleo
DNA RNAEssere attivo
PROTEINACELLULA
DISEGNO DI UN ODN
1. Uso di programmi (es. MFOLD) che predicono il “folding” dell’RNA per identificare siti di ibridazione accessibili
2. “Gene walking”: si genera una serie di ODNs contro l’mRNA target e si valuta l’attivita’ di ciascuno in cellule o in vivo
3. “RNAsi H mapping”: si basa sul fatto che tale enzima riconosce e degrada selettivamente la catena di RNA in eteroduplex RNA-DNA. Si combina l’mRNA target con una libreria di ODNs random in presenza di RNAsi H, l’analisi dei frammenti tagliati permette di individuare i siti accessibili
4. “ODN scanning arrays”: Si costruisce un array sintetizzando ODN che coprono ogni sito dell’RNA bersaglio, si ibrida dunque con l’RNA target radiomarcato. Questa metodologia permette di individuare la sequenza di possibili ODN
MODIFICA CHIMICA DEGLI ODNPERCHE’ ?
1- per migliorare l’uptake cellulare
2- per aumentare la stabilità alle
nucleasi
COME ?
A- apportando modifiche ai gruppi
ossidrili del fosforo
B- all’ossidrile 3’ del ribosio
C- alle basi
MODIFICHE UTILIZZATE SU ODN
Y WM
X
Z
OO
Base
-O OP
O
O
GRUPPO FOSFATO
ZUCCHERO
Base
OR’
O
OAlch
2’-O-Alchil-RNA
M W X Y ZP O O O O fosfodiestereP Oalch O O O fosfotriestereP Me O O O metilfosfonatoP S O O O fosforotioatoP S O S O fosforoditioatoP O NH O O 3’-fosforammidatoP O O O NH 5’-fosforammidatoC H O H O formacetaleS O O O CH2 solfonato
OR’
BaseOHO
arabinonucleoside
Base
OR’
O
Alfa-nucleoside
OBase
OR’
Omo-DNA
Base
OR’
O
aODN di prima generazione
FOSFOROTIOATI: Sono analoghi degli aODN naturali in cui uno degli ossigeni non a ponte del legame fosfodiesterico è stato sostituito con un atomo di zolfo.VANTAGGI: - stabili alle nucleasi - facile sintesi - attivazione dell’RNAsi HSVANTAGGI: - poco assorbiti - modesta tossicità
METILFOSFONATI: Un ossigeno non a ponte del legame fosfodiesterico è sostituito con un gruppo metilico.VANTAGGI: - minore solubilità quindi maggiore concentrazione intracellulare
SVANTAGGI: - non attivano l’RNAsi H
O
P O
S
O
Base
Base
O
O
O
P O
CH3
O
Base
Base
O
O
aODN di seconda generazione
2’-O-metil o metossietil RNA: aggiunta di un gruppo metile o metossietile in posizione 2’ nel ribosioVANTAGGI: - meno tossici dei fosforotioati - maggiore affinità per RNA complementare - attivazione dell’RNAsi HSVANTAGGI: ridotta attività
Oligonucleotidi antisenso GAPMER: blocco centrale di deossinucleotidi che attivano RNasi H fiancheggiati da ribonucleotidi con gruppi metile in 2’-O che proteggono il blocco interno dalla degradazione da parte di nucleasi
aODN di terza generazione
Vantaggi: - migliore stabilità termica
PNA: l’ossatura di zucchero fosfati è
sostituita da legami poliammidici
VANTAGGI:Aumentata stabilità e affinità
SVANTAGGI: Non attivano RNasi H,
problemi di solubilità e di uptake cellulare
LNA: l’anello del ribosio è chiuso da un ponte
metilene che collega 2’-O con 4’-C
VANTAGGI:Aumentata stabilità termodinamica
e affinità
SVANTAGGI: ridotta capacità di
silenziamento
Non attiva RNasi H
HNA (Hexytol nucleic acids): al posto del
desossiribosio si trova un esitolo che è più rigido e porta a una
riorganizzazione dell’HNA
VANTAGGI:Aumentata resistenza alle nucleasi
termodinamica e affinità
SVANTAGGI: non attiva RNasi H
MFs (Morpholino oligonucletides): il
risHNA (Hexytol nucleic acids): al posto del ribosio si trova una
molecola morfolino e i legami sono
fosforodiammidici
VANTAGGI:Aumentata resistenza alle nucleasi
termodinamica e affinità
SVANTAGGI: non attiva RNasi H , problemi di
uptake cellulare
PNA ( Peptide Nucleic Acids )
• Uno scheletro di tipo peptidico mima la struttura del DNA
• Le basi mantengono tra loro la distanza che avevano nel DNA e quindi possono riconoscere le basi complementari
• La sintesi segue schemi identici a quella per i peptidi
• La struttura risultante è di natura non ionica, stabile alle nucleasi, proteasi e peptidasi
VANTAGGI: - facilità di sintesi
- modulabilità delle proprietà chimico-fisiche (il gruppo ammidico può essere opportunamente funzionalizzato)
- grande stabilità del complesso PNA-DNA grazie alla mancanza della carica degli oligomeri di PNA
- sono più resistenti all’attacco di proteasi e nucleasi
SVANTAGGI: - non sono attaccati da RNAsi
- non penetrano la membrana cellulare
- possono non essere selettivi
PNA: VANTAGGI E SVANTAGGI
CONFRONTO STRUTTURA CHIMICA
TRA DNA E PNA
O
O OP
OBase
O
OO
Base
OR’
-
DNA
NH2
NBase
O
O NH
NBase
O
O OH
PNA
Nel 1992 fu pubblicato il primo studio sull’applicazione di PNA: PNA microiniettati (1 M) nei nuclei di cellule in coltura hanno bloccato la sintesi della proteina T Ag di SV40.
Diversi gruppi hanno studiato l’effetto antisenso dei PNA in vitro su estratti nucleari di epatociti di ratto e hanno riportato un’inibizione della traduzione dell’mRNA che codifica per il recettore a dell’IL-2, la cloramfenicolo acetiltrasferasi, l’iNOS…
Nel 1998 si hanno i primi risultati in vivo. PNA contro la neurotensina e il recettore degli oppioidi sono stati iniettati in ratti e hanno ridotto drasticamente la risposta alla neurotensina e alla morfina. Gli effetti sono reversibili e le risposte tornano normali dopo 5-14 giorni dall’iniezione
Sono stati studiati PNA che bloccano specificamente l’interazione del fattore di trascrizione NF-kB con il suo sito di legame nel promotore di IL2-R
PNA contro l’mRNA della prepro-ossitocina riducono la quantità dell’mRNA per l’ossitocina in modo tempo e dose dipendente
APPLICAZIONI DI PNA
FARMACOCINETICA CELLULARE DI ODN
In vitro gli ODN attraversano la membrana cellulare con un processo di pinocitosi ed endocitosi mediata da recettore.
La concentrazione intracellulare è 1-3% di quella extracellulare, se veicolati da agenti lipofili arriva a 10-20%
La lunghezza dell’oligo è inversamente proporzionale all’uptake cellulare
Non tutto l’ODN internalizzato esercita un effetto poiche’ gran parte e’ sequestrato nei compartimenti endosomiali o lisosomiali.
Studi in vitro dimostrano una compartimentalizzazione di ODN anche all’interno di altri organelli citoplasmatici, questo non sembra vero in vivo
L’emivita intracellulare degli oligo naturali è di 2-4 ore. Tale emivita è decisamente influenzata dalla natura chimica dell’ODN
FARMACOCINETICA-2
Somministrazione per via endovenosa, peritoneale, topica, oftalmica, inalatoria e orale. La via orale dà buoni livelli circolanti però l’assorbimento è irregolare
L’emivita plasmatica degli ODN naturali è assai breve, dovuta alla degradazione da parte delle nucleasi sieriche e alla captazione dai tessuti periferici (ridistribuzione). Piu’ somministrazioni sono in genere richieste per avere una certa efficacia, questo e’ particolarmente importante se il target ha un basso turnover. Esempio PERIFERINA= proteina dei filamenti intermedi tipica dei neuroni, half life=7 giorni circa, la somministrazione ripetuta di ODN per piu’ di 40 giorni porta alla riduzione del 90% di livelli di periferina
Sono disponibili sistemi impiantabili a base di polimeri biodegradabili in grado di rilasciare il composto attivo per piu’ di un mese (il rilascio e’ in funzione della chimica e lunghezza dell’ODN)
FARMACOCINETICA DEI FOSFOROTIOATI
I FOSFOROTIOATI, somministrati per via sistemica, si distribuiscono rapidamente in tutti gli organi tranne il SNC. L’assorbimento determina una rapida diminuzione dei livelli plasmatici e l’equilibrio si stabilisce entro 20-30 minuti dalla somministrazione.
La concentrazione che si ottiene è sufficiente per l’azione farmacologica.
L’emivita è di 16-18 ore.
L’eliminazione è degradativa (20-30% nelle urine dopo 24 ore). Non si è osservata eliminazione fecale.
Si suggerisce per terapia sistemica 10-50 mg/kg.
Dopo somministrazione intravenosa gli oligo possono essere rintracciati in una varietà di tessuti con la percentuale più alta di accumulazione nel rene (cellule dei tubuli prossimali) e nel fegato (cellule endoteliali) seguiti da milza e midollo osseo e in minime quantità nelle cellule ematiche mononucleari periferiche (PBMCs).
DISTRIBUZIONE ED ELIMINAZIONE DI aODN
VEICOLAZIONE DI ODN PER
USO TERAPEUTICO-1
Data la veloce eliminazione degli ODN plasmatici liberi è necessario che essi siano specificamente veicolati verso le cellule del tessuto bersaglio.Le strategie di trasferimento degli ODN sono diverse e tutte implicano il processo di adesione alla membrana e il successivo rilascio all’interno della cellula con inclusa efficienza, stabilità ed assenza di effetti citotossici.
I liposomi incapsulano gli ODN nel centro acquoso. I lipidi cationici dotati di carica positiva facilitano la incorporazione di DNA (a carica negativa) e il trasporto nella cellula mediante fusione con le membrane cellulari o endocitosi mediata da recettori. Per facilitare il rilascio dall’endosoma o liposoma si puo’ incorporare un lipide helper = DOPE (dioleil fosfatidiletanol amina) che distrugge la parete endosomiale. Un’altra strategia consiste nell’utilizzare liposomi pH sensibili: a PH acido il liposoma collassa e cio’ determina la fusione con la membrana endosomiale e il rilascio del contenuto nel citoplasma.
VEICOLAZIONE DI ODN PER
USO TERAPEUTICO-2
1. LIPOSOMI CON LIPIDI CATIONICI
2. NANOPARTICELLE E MICROSFERE:
Le NANOPARTICELLE sono veicolanti colloidali di dimensioni nanometriche. Sono costituite da polialchil-ciano-acrilati (PACA), molto biodegradabili e a basso costo. Poiche’ hanno superficie carica negativamente si utilizzano copolimeri cationici o detergenti idrofobi cationici per facilitare il legame dell’ODN che rimane adsorbito alla superficie carica
Le MICROSFERE hanno dimensioni comprese tra 1 e 100m, sono a base di zuccheri biodegradabili che consentono il rilascio ritardato di acidi nucleici. Microsfere PLGA (acido poli(DL-lattico-coglicolico)) sono le piu’ usate
VEICOLAZIONE DI ODN PER
USO TERAPEUTICO-3
3. RILASCIO MEDIATO DA UN PEPTIDE CARRIER:
Una delle più potenti strategie per il rilascio all’interno delle cellule di ODN è basata sull’uso di un breve peptide chiamato MPG (27 residui). MPG contiene un dominio idrofobico derivato dalla fusione di sequenze gp41 dell’HIV ed un dominio idrofilico derivato dalla sequenza dell’antigene T dell’SV40. MPG ha un’alta affinità per il DNA sia a singola elica che a doppia elica. I legami principali tra MPG e l’ODN avvengono attraverso interazioni elettrostatiche che coinvolgono residui basici del peptide vettore. Il rapporto MPG/ODN deve essere molto elevato (dell’ordine di 20/1). Questa nuova strategia offre diversi vantaggi rispetto agli altri approcci comunemente in uso, aumentando la stabilità degli ODN nei confronti delle nucleasi e facilitando l’attraversamento della membrana plasmatica.
VEICOLAZIONE DI ODN PER
USO TERAPEUTICO-4
VEICOLAZIONE DI ODN PER
USO TERAPEUTICO-5
5. CONIUGAZIONE:
Composti coniugati con oligonucleotidi: LIGANDI (ferritina, porfirina, EGF, anticorpi): potenziano
l’uptake cellulare per endocitosi e per via recettoriale LIPIDI (colesterolo, PEG, poli L-lisina): aumentano il
passaggio passivo attraverso le membrane e incrementano la stabilità
INTERCALANTI (psoralene, acridina, antracicline): accrescono la stabilità della doppia elica
MARCANTI (biotina, fluoresceina)
4. VIRUS:
Durante l’assemblaggio del capside l’ODN terapeutico viene incorporato nello spazio intravirale sostituendo il contenuto nucleico originale.
TOSSICOLOGIA CELLULARE DEGLI ODN
Solo per concentrazioni superiori a 100 M
Possono causare 10-20% di inibizione della proliferazione cellulare forse per ibridazioni parziali aspecifiche
Non sono state mai descritte mutazioni permanenti per inserimento degli oligo nel DNA
Non sono state mai descritte trasformazioni neoplastiche
TOSSICOLOGIA IN VIVO
TOPO DL/50 350 mg/kg I.V e I.P.
RATTO DL/50 100 mg/kg/giorno/3 mesi
Sofferenza epatica solo in caso di somministrazione di tioati.
Non ci sono effetti teratogeni
aODN:SETTORI DI UTILIZZO
TERAPEUTICO-1
1. CONTROLLO DELLA CRESCITA NEOPLASTICA:
PRIMA GENERAZIONE: aODN contro mRNA importanti nel ciclo mitotico (subunità polimerasi, myc..)
SECONDA GENERAZIONE: aODN contro le traslocazioni cromosomiche di linfomi e leucemie
2. TERAPIA ANTIVIRALE:
HIV: AIDS blocco delle proteine essenziali per il ciclo riproduttivo (TAT,REF)
Herpes Simplex: impiego clinico per cheratite erpeticaVirus influenzali
aODN:SETTORI DI UTILIZZO
TERAPEUTICO-2
4. CARDIOLOGIA:
Ipertensione: aODN contro geni che sintetizzano per molecole vasoattive (renina-angiotensina, recettore adrenergico, endotelina e neuropeptide Y, callicreina,peptide natriuretico atriale, NO, calcitonina)
Ischemia miocardica
Nel controllo della ristenosi sono utilizzati per inibire la proliferazione endotelio-intima muscolare delle arterie coronariche dopo stress meccanico (azione sull’m-RNA che codifica per il PDGF)
AODN IN VIROLOGIA
1. esperimenti su animali da laboratorio hanno evidenziato un effetto anti-HIV di un ODN di 28 mer complementare al gene tat dell’HIV. In pazienti con AIDS conclamata, utilizzato alla concentrazione di 3,6 mg/kg per via endovenosa, non ha dato effetti positivi. Attualmente la Hybridon sta studiando una sequenza (GEM 91) che sembra bloccare non solo la replicazione dell’HIV ma anche inibire il suo legame alle cellule.
2. ODN contro Citomegalovirus = FOMIVIRSEN (VitraveneTM), responsabile della cecità registrata in alcuni pazienti affetti da AIDS. Somministrazione topica per via intra-oculare. Approvato nel 1998 per il commercio in USA e nel 1999 per l’Europa
3. ODN anti influenzale. Blocca l’espressione del gene ICAM 1 che funge da recettore per il passaggio del virus all’interno della cellula
4. ODN contro Papillomavirus (HPV) probabilmente responsabile del tumore della cervice uterina. Somministrazione intra-papilloma o per pomata
aODN IN ONCOLOGIA
I GENERAZIONE
Studi di somministrazione topica di DNA associato a nanoparticelle che ha come bersaglio il gene Ras, somministrato a pazienti con carcinoma alla vescica
II GENERAZIONE
Tumori sistemici (leucemie e linfomi): ODN diretti ad ibridizzare le sequenze originate dalla
traslocazione cromosomica 8:14 nel linfoma di Burkitt, 9:21 (cromosoma Filadelfia) nella leucemia mieloide cronica, 14:18 nella leucemia B umana.
LEUCEMIA B UMANA
Traslocazione cromosomica 14:18. A) La doppia rottura del cromosoma 18 nel gene bcl-2 e del cromosoma 14 nel locus della catena pesante delle immunoglobuline (IgH) determina (B) la formazione del gene ibrido bcl-2-IgH formando una sequenza nucleotidica specifica nel punto di giunzione (C).
Ch.18 bcl-2 V D Ch.14J E IgH
bcl-2 J6 E IgHN
5’ TGCAGTGGTGCT CCCTGGTTCCCCGAA TACTACTACCTA 3’
bcl-2 sequenza specifica IgH
A)
B)
C)
aODN CONTRO GENI CANCRO-CORRELATI-1
C-myc: Inibizione della proliferazione sia nei linfociti T sia delle cellule HL60, le quali sono indotte ad un differenziamento spontaneo; inibizione della crescita di una linea tumorale derivata da un linfoma di Burkitt
C-myb:Inibizione dell’attività proliferativa delle cellule mieloidi in coltura, dei precursori emopoietici mieloidi nrmali e dei T-linfociti PHA stimolati
C-abl: Parziale inibizione della capacità proliferativa e della formazione di colonie mieloidi
Cdc2: Inibizione della proliferazione dei linfociti T PHA stimolati
Bcl-2: Inibizione della proliferazione di cellule leucemiche con massiva morte cellulare
CSF-1: Prevenzione della senescenza di cellule endoteliali umane, aumento della capacità proliferativa
BCR/ABL: Soppressione della formazione di colonie di cellule di leucemia mieloide cronica
P53: Soppressione della formazione di colonie di cellule di leucemia mieloide acuta
Protimosina : Inibizione della proliferazione delle cellule mielomatose
Butirrilcolinesterasi:Inibizione selettiva della megacariocitopoiesi
aODN CONTRO GENI CANCRO-CORRELATI-2
EFFETTO ANTITUMORALE DI aODN ANTI-MYB
10
8
6
4
2
00 12 24 36 48
aODN anti-myb
Non trattati
ODN controllo
ODN IN ALTRE PATOLOGIE
PSORIASI: ODN per diminuire la velocità di proliferazione delle cell della pelle o contro un difetto del sist imm.
RETINITE indotta da infezione da citomegalovirus: Vitravene
TRATTAMENTO DELL’ASMA: L’Hybridon ha messo a punto un antisenso in grado di inibire le espressioni delle interleuchine durante la risposta immunitaria.
MORBO DI CROHN: ISIS 2302 e’ in fase II, esso inibisce la sintesi di una proteina di adesione cellulare che favorisce il passaggio delle cellule infiammatorie attraverso i vasi sanguigni
SCLEROSI MULTIPLA: la ISIS ha cercato di mettere a punto un ODN contro il recettore VLA4 sulla superficie dei linfociti per bloccare l’inappropriata migrazione di linfociti nel SNC che contribuisce alla patogenesi della malattia
DISTROFIA MUSCOLARE DI DUCHENNE: effetto positivo di trattamenti intramuscolari
Dystrophin is a rod-shaped cytoplasmic protein, and a vital part of a protein complex that connects the cytoskeleton of a muscle fiber to the surrounding extracellular matrix through the cell membranes. This complex is variously known as the costamere or the dystrophin-associated protein complex. Many muscle proteins, such as α-dystrobrevin, syncoilin, synein, sarcoglycan, dystroglycan, and sarcospan, colocalize with dystrophin at the costamere.As of 2007, dystrophin is the longest gene known, covering 2.4 megabases (0.08% of the human genome) at locus Xp21. The primary trancript measures about 2,400 kilobases and takes 16 hours to transcribe, the mature mRNA measures 14.0 kilobases. The 79 exons code for a protein of over 3500 amino acid residues.
Exon skipping: una nuova applicazione per oligonucleotidiAntisenso: l’esempio della patologia di Duchenne 1.
Exon skipping: una nuova applicazione per oligonucleotidiAntisenso: l’esempio della patologia di Duchenne 2.
Utilizzo di acidi nucleici per alterare la maturazione di RNA:
-Blocco sito di splicing criptico- esclusione di esoni- inclusione di esoni
PROBLEMATICHE RIGUARDANTI GLI
ANTISENSO IN TERAPIA
1. Scarsa riproducibilità negli esperimenti in colture cellulari
2. Uso fosforotioati
3. Variabilità del grado di purezza delle diverse preparazioni
4. Uptake cellulare ancora poco definito
5. Costo
ODN DI SECONDA GENERAZIONE-1
Proprietà biologiche Affinità
Substrato dell’Rnasi H Farmacocinetica cellulare
Proprietà farmacocinetiche
Stabilità in vivo Rilascio sito specifico Emivita plasmatica
Il modello di oligonucleotide deputato ad assolvere tutte queste funzioni e a mostrare tutte queste proprietà sembra rappresentato dalla classe degli MBO (mixed backbone oligonucleotides). Un ODN chimerico ultimamente approntato possiede una breve sequenza di DNA fosforotioato (3-9 basi) usata per attivare l’Rnasi H e un braccio ibridizzante fornito di nucleotidi modificati che non formano substrati per l’Rnasi H. Nucleotidi 2’-O-Metil o 2’-fluoro modificati sono stati usati per i bracci ibridizzanti. Il gruppo 2’-O-metile incrementa l’affinità dell’oligomero per l’RNA target e ne aumenta l’attività in coltura. Gli MBO mostrano una elevata stabilità in vivo che potrebbe consentire somministrazioni meno frequenti nonché meno gravi effetti locali legati alla natura polianionica e alla risposta immunitaria. Questo è dovuto al ridotto numero di legami fosforotioati contigui oltre che alla posizione centrale dei segmenti modificati.
ODN DI SECONDA GENERAZIONE-2