BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE

LEZIONE n° 5siRNA

CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO

AA 2008-09Adriana Maggi

Nuovi target farmacologici: GLI ACIDI NUCLEICI

Duplicazione

DNA duplicato

DNA RNA

TrascrizioneMaturazioneMetabolismo

Traduzione

PROTEINA

FARMACI TRADIZIONALI

ACIDI NUCLEICI COME TERAPEUTICI

1. ANTISENSO: desossinucleotidi complementari con l’m-

RNA

2. ANTIGENE: desossinucleotidi complementari al DNA

3. RIBOZIMA: ribonucleotidi catalalitici complementari a

RNA

4. APTAMERI: desossi e ribonucleotidi complementari a una

sequenza aminoacidica (competono

con l’RNA nella interazione tra RNA e

proteina)

5. DECOY: DNA complementare a sequenze

aminoacidiche (competono con

sequenze di DNA nell’interazione DNA-

proteina)

6. siRNA: RNA complementari a sequenze specifiche

RNA Interference: il processo attraverso il quale un RNA a doppio filamento interferisce con l’espressione genica:sia inducendo la degradazione di RNA complementare che bloccandone la traduzione

http://www.nature.com/focus/rnai/animations/index.html

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006

"for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA"

                        

Andrew Z. Fire Craig C. MelloStanford University University

of Massachusetts b. 1959 b. 1960

In 1998 Fire and Mello described the presence of si RNA in C.elegans

Nel 2001 Tuschl et al. dimostrano che una piccola sequnza di RNA puo’ interferire in modo specifico con la trascrizione

Interferenza basata su RNA (RNA interference)

Attori:

Micro RNA (miRNA) precursori a forcina

Ribonucleasi DICER

Small interfering RNA (Si) (2 nt 3’ protrundenti)

RISC RNA RNA driven interference silencing complex che comrende: Argonaute, la proteina che srotola il doppio filamento e la ribonucleasi che taglia la sequenza senso 8° 10-11 nt risptto al terminale 5’.

Il complesso RISC attivato riconosce sequenze complementari di RNA, le lega e degrada: questo puo’ avvenire diverse volte in quanto l’RNA antisenso, protetto dal complesso proteico è stabile e in cellule che si dividono lentamente puo’ agire per 3-7 giorni.

                                

                                     

Risc unwinds dsRNA,the ribonuclease in the Ribonuclese complex hydrolizes new targets

Nature Reviews Genetics 2007, 8:884

LOCI NATURALI CHE GENERANO siRNA

RNA-directed DNA methylation (descritta in vegetali)

RNA interference-mediated heterochromatin assembly

siRNAs are thought to guide histone methyltransferases (HMTs) to the chromatin to modify histone H3 on lysine 9 (H3K9). The methylated form of H3 is bound by Swi6 or HP1, which also associates with the methyltransferases, to maintain the silenced state. m, methyl group.

Marjori A. Matzke & James A. BirchlerNature Reviews Genetics 6, 24-35 (January 2005

Attività di siRNA a livello del nucleo

Metilazione di citosine in frammenti di DNA complementari (descritta in vegetali)

Riorganizzazione della cromatina (descritto in lievito, cellule vegetali e di insetto: siRNA determinano la metilazione di istoni e la formazioe di eterocromatina)

Excisione programmata di DNA in eccesso (protozoi)

siRNA sinteticoa doppio filamento

shRNA plasmidico

RNA lungo a doppio filamento

miRNA endogeno

20-25 NT

funzionemiRNA

Formazione del complesso RISC (RNA induced silencing complex)

Complesso RISC attivato

Blocco traduzione

funzionesiRNA

Formazione doppia elica con RNA complementare e attacco di endonucleasi

Amplificazione RNA-dip RNA polimerasi

si RNA – caratteristiche

RNA a doppia elica di 21-23 ntPresenza di terminale 3’ più lungo di 2ntPresenza di gruppi OH in 3’Presenza 5’ fosfatoAlta stabilità nella porzione 5’ senso(ricco in GC)Bassa stabilità nella porzione 5’ antisenso(ricco UA)Bassa stabilità nella zona centrale dove deve avvenire l’attacco della endonucleasi2’ desossitimidina per proteggere siRNA da attività esonucleasiche

Non deve essere complementare a zone intronicheComplementare a una porzione di RNA a non più di 75 basi da codone di inizio trad.

si RNA – caratteristiche

In rosso: siRNA marcatoIn blu: nucleiIn verde la proteina GAPDH

CELLULE HELA

si RNA non specifico si RNA contro GAPDH

Trattamento: 48h

siRNA come agenti terapeutici

LA DISTRIBUZIONE

Problematiche tipiche delle molecole di grandi dimensioni e che sono altamente polari

Degradabilità dovuta a Rnasi circolanti (RNA naturale puo’ essere utlizzato in cervello e polmoni)

Ideale per applicazione topica (occhi, derma, tumori localizzati)

siRNA come agenti terapeutici

LA SOMMINISTRAZIONE

siRNA come agenti terapeutici

LA SOMMINISTRAZIONE

1. Applicazione topica: instillazione di gocce, aerosol, iniezione intratumorale

2. Somministrazione sistemica: a. iv (molecole di circa 5nm riescono a passare le

membrane, fino a 200 nm passano solo capillari fenestrati : uso di nanocarrier)

b. RNA di sintesi modificati per migliorarne la farmacocinetica

c. Utilizzo di vettori virali e non per esprimere l’RNA a

della cellula bersaglio

siRNA come agenti terapeutici

LA SOMMINISTRAZIONE

Modificazione delle molecole di siRNA per una distribuzione più efficiente

modificazioni per evitare le difese immunitarie (modificazione con 2’-o-metile nel filamento antisenso)

fosforotionati per bloccare esonucleasi

coniugazione con peptidi, colesterolo, PEG

BIODISTRIBUZIONE

Anton P. McCaffrey*, Leonard Meuse*,

Thu-Thao T. Pham*, Douglas S. Conklin†,

Gregory J. Hannon†, Mark A. Kay*

Nature, 2002

siRNA IN STUDI CLINICI

Similarità e differenze con oligonucleotidi antisenso

Similarità: - lunghezza- metodologia di delivery comune- induzione di silenziamento genico a livello post-trascrizionale- digestione di RNAm bersaglio da parte di endonucleasi- possibilità di stabilizzzione con basi

modificate- similarità nella biodistribuzione

Differenze: - doppio filamento verso singolo filamento- maggiore stabilità della molecola naturale- maggiore efficacia in cellule in coltura- meccanismo di azione mediato da RISC

Riferimenti bibliografici

Chapman E and Carrington J. Specialization and evolution of endogenous small RNA pathways. Nature Rewievs Genetics 2007, 8:884

Iorns E et al. Utilizing RNA interference to enhance cancer drug discovery. Nature Rewievs Drug Discovery 2007, 6:556

Kawakami S. and Hashida M. Targeted delivery of small interefering RNA by systemic adminitrtion.Drug Metab. Pharmacokin 2007, 22: 142

Kathryn A. Whitehead, Robert Langer & Daniel G. Anderson Knocking down barriers: advances in siRNA delivery Nature Reviews Drug Discovery 8, 129-138 (February 2009)