Clonaggio: vettori plasmidici

I plasmidi sono molecole di DNAextra-cromosomali che si auto-replicano

Sono presenti in natura in batteri, lievitie alcuni eucarioti superiori, in uno statodi relazione parassitica o simbionticaverso la cellula ospite

Molti plasmidi contengono caratteri (geni)che arrecano beneficio alla cellula ospite (es.resistenza a un antibiotico)

Molti plasmidi sono in grado di auto-trasferirsi da una cellula all’altra.

• VETTORI PLASMIDICI -> 0-10 kb

• VETTORI di inserzione -> 0-10 kb

• VETTORI di sostituzione -> 9-23 kb

• VETTORI COSMIDICI -> 30-44 kb

• VETTORI PAC (crom. artif. P1) -> 130-150 kb

• VETTORI BAC (crom. artif. batt.)-> fino a 300 kb

• VETTORI YAC (crom. artif.lievito-> 0.2-2 Mb

Il batteriofago

–Libreria genomica: collezione di cloni che include tutto il DNA genomico di una certa specie (es. il genoma umano aploide contiene circa 3x109 coppie di basi, che possono essere contenute in circa 1.5x105 cloni di 20 kb ciascuno)

–Libreria di cDNA: collezione di cloni che include tutte le specie di mRNA (trascritte in cDNA) espresse in un dato tessuto, incluso quelle piu’ rare

Le genoteche o librerie di DNA:

Costruzione di una libreria genomica

Costruzione di librerie genomiche utilizzando il fago come vettore

---GGATCC------CCTAGG---

---G GATCC------CCTAG G---

BamH1

---GATC------CTAG---

--- GATC------CTAG ---

Sau3A

--- GATC------CTAG ---+

---GATC------CTAG---

BamH1 Sau3A Sau3A

---G GATCC------CCTAG G---

Costruzione di una libreria di cDNA

Analisi dei cloni ottenuti

• Crescita dei cloni, purificazione del DNA plasmidico o fagico e analisi con enzimi di restrizione

• Sequenziamento

• sottoclonaggio

Separazione di frammenti di DNA (o RNA) di diversa lunghezza tramite elettroforesi

Visualizzazione dei frammenti separati per elettroforesi

MAPPE DI RESTRIZIONE

Mappare multipli siti di restrizione

Separazione di frammenti di DNA (o RNA) di diversa lunghezza tramite elettroforesi

IBRIDAZIONE DI ACIDI NUCLEICI

• La messa a contatto risultante nell’appaiamento di frammenti a singolo filamento provenienti da due fonti diverse: una sonda (popolazione omogenea di molecole note marcate) e un bersaglio (complessa ed eterogenea popolazione di molecole di acido nucleico).

• Usata per determinare la presenza o la quantita’ di acidi nucleici con una sequenza specifica corrispondente a quella della sonda nel campione biologico analizzato.

• Le condizioni a cui si effettua la reazione di ibridazione determinano il grado di divergenza delle sequenze analizzate (stringenza).

STRINGENZA

• La Tm (temperatura di fusione o melting T) caratterizza la stabilita’ dell’ibrido che si forma tra la sonda e il suo filamento complementare.

• La Tm e’ critica per determinare la temperatura ottimale per usare sonde oligonucleotidiche come sonde per ibridizzare o come inneschi per la reazione di PCR, o sonde non perfettamente complementari.

• La Tm dipende da:– Lunghezza della sonda

– Composizione in basi (G+C e A+T)

– Grado di omologia

– Concentrazione della sonda e del bersaglio

– Ambiente chimico:• Concentrazione salina (i cationi monovalenti come ioni Na+ stabilizzano la

doppia elica, i denaturanti chimici come formamide o urea la destabilizzano)

Ibridazione su membrana

DNA a doppio filamento

fusione

Il DNA si lega sul filtro

DNA a singolo filamento

Incubare con sonda marcata

filtro

Lavare via il DNA marcato non ibridizzato

autoradiografia

Sonde per ibridazione

• DNA

• RNA

Marcate sia

- tramite radioattivita’(nucleotidi trifosfati con un fosforo radioattivo)

- tramite l’uso di guppi fluorofori (nucleotidi trifosfati coniugati con guppo fluoroforo)

Marcatura enzimatica di una sonda a DNA (oligolabeling)

Marcatura di una sonda a RNA tramite sintesi in vitro

IBRIDAZIONE DI ACIDI NUCLEICI su membrana

• DNA->DNA – Southern blot– Ibridazione di colonie batteriche o placche fagiche - screening di librerie

• DNA->RNA (Northern blot)

• Southern e Northern blot individuano frammenti di DNA o RNA bersaglio gia’ suddivisi in base alle dimensioni tramite elettroforesi su gel

Trasferimento secondo Southern (Southern blot)

• Il Southern blot permette di effettuare mappaggi di restrizione sia su DNA genomico totale che su DNA ricombinante

• di individuare i cosiddetti polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP)

• di individuare le delezioni o inserzioni geniche

Mappatura della mutazione che determina l’anemia falciforme, che distrugge un sito MstII e genera un RFLP specifico per la malattia

MstII: CCTNAGG

Colony o plaque lift e ibridazione