DIAGNOSTICA CLINICA

E

MICROBIOLOGICA

Benedetta Cremonesi

DELEGAZIONE REGIONALE LOMBARDIA

CORSO DI PREPARAZIONE

ALL’ESAME DI STATO PER L’ABILITAZIONE

ALLA PROFESSIONE DI BIOLOGO (Sez.A-Sez.B))

IL BIOLOGO NEL SISTEMA SANITARIO NAZIONALE (SSN)

REQUISITI DI ACCESSO AL SSN

SERVIZIO DI MEDICINA DI LABORATORIO: ASPETTI

ORGANIZZATIVI E RUOLO DEL BIOLOGO

PRINCIPALI TECNICHE ANALITICHE NELLA DIAGNOSTICA

CLINICA E MICROBIOLOGICA

Il Biologo nel

Sistema Sanitario Nazionale

Benedetta Cremonesi

Link http://www.salute.gov.it/ temi e professioni

Esistono gli Ordini Professionali per:

Medici chirurghi e Odontoiatri, Veterinari, Farmacisti, Psicologi, Chimici e

Fisici, Biologi, Professioni infermieristiche, Ostetriche, Tecnici sanitari di

Radiologia medica e delle Professioni Sanitarie Tecniche, della

Riabilitazione e della Prevenzione

Lo stato italiano riconosce attualmente 30 professioni SANITARIE tra

cui quella di Biologo (L. 24.05.1967, n° 396)

Per l’esercizio di tali professioni è obbligatoria l’iscrizione ai rispettivi

ORDINI PROFESSIONALI che promuovono:

• autonomia delle professioni sanitarie

• qualità delle prestazioni

• principi etici dell'esercizio professionale indicati nei codici deontologici,

a garanzia della salute delle persone)

Circa 1,200,000 professionisti che operano in strutture sia pubbliche che

private

Figura professionale di Biologo istituita con la Legge 396/67Legge 24

Maggio 1967,

n.396

Ordinamento

della Professione

di Biologo

Legge 24

Maggio 1967,

n.396

Ordinamento

della Professione

di Biologo

[…]

Art. 15 (a). Disciplina della dirigenza del ruolo sanitario

Decreto

Legislativo

30 dicembre

1992,

n. 502

Riordino della

disciplina in

materia sanitaria

La collocazione dei dirigenti biologi nel SSN:rientra negli ambiti professionali riconosciuti dalla legislazione

La dirigenza del ruolo sanitario e' articolata in due livelli.

Al personale medico e delle altre professionalita' sanitarie del

primo livello sono attribuite le funzioni di supporto, di collaborazione

e corresponsabilita', con riconoscimento di precisi ambiti di

autonomia professionale, nella struttura di appartenenza, da attuarsi

nel rispetto delle direttive del responsabile.

Al personale medico e delle altre professionalita' sanitarie del

secondo livello sono attribuite funzioni di direzione ed

organizzazione della struttura da attuarsi anche mediante direttive

a tutto il personale operante nella stessa e l'adozione dei

provvedimenti relativi, necessari per il corretto espletamento del

servizio;

Al primo livello dirigenziale del ruolo sanitario si accede

attraverso concorso pubblico

Il secondo livello dirigenziale del ruolo sanitario viene conferito

come incarico

Decreto

Legislativo

19 giugno 1999,

n. 229

Norme per la

razionalizzazione

del SSN

Art. 13

(Modificazioni all'articolo 15 del D.L. 30 dicembre 1992, n.502)

L'articolo 15 del decreto legislativo 30 dicembre 1992, n.502,

e successive modificazioni, e' sostituito dai seguenti:

"Art. 15 (Disciplina della dirigenza medica e delle professioni

sanitarie)”

La dirigenza sanitaria e' collocata in un unico ruolo, distinto per profili

professionali, ed in un unico livello, articolato in relazione alle

diverse responsabilita' professionali e gestionali.

Alla dirigenza sanitaria si accede mediante concorso pubblico

per titoli ed esami, disciplinato ai sensi del D.P.R. 10 dicembre

1997, n.483.

Tutti i dirigenti – medici e non medici – ad eccezione di quelli

amministrativi, svolgono anzitutto un’attività professionale alla

quale può affiancarsi un incarico gestionale in senso proprio

Requisiti di accesso al

Sistema Sanitario Nazionale

Benedetta Cremonesi

D.P.R.

10 dicembre

1997,

n. 483

Regolamento

recante la

disciplina

concorsuale per il

personale

dirigenziale del

SSN

Accesso alla Sanità Pubblica

Requisito obbligatorio : iscrizione all’ordine professionale

D.P.R.

5 giugno 2001,

n. 328

Modifiche ed

integrazioni della

disciplina dei

requisiti per

l’ammissione

all’esame di Stato

e delle relative

prove per

l’esercizio di

talune

professioni,

nonché della

disciplina dei

relativi

ordinamenti

Art. 33 L'iscrizione nella sezione B è subordinata al

superamento di apposito esame di Stato.

Per l'ammissione all'esame di Stato è richiesto il possesso della

laurea in una delle seguenti classi:

a )Classe 12 - Scienze biologiche;

b )Classe 1 - Biotecnologie;

c) Classe 27 - Scienze e tecnologie per l'ambiente e la natura

art.32 L'iscrizione nella sezione A è subordinata al

superamento di apposito esame di Stato.

Per l'ammissione all'esame di Stato è richiesto il possesso della

laurea specialistica in una delle seguenti classi:

a) Classe 6/S - Biologia;

b) Classe 7/S - Biotecnologie agrarie

c) Classe 8/S - Biotecnologie industriali;

d) Classe 9/S - Biotecnologie mediche, veterinarie, e

farmaceutiche;

e) Classe 82/S - Scienze e tecnologie per l'ambiente e il

territorio;

f) Classe 69/S - Scienze della nutrizione umana.

D.P.R.

5 giugno 2001,

n. 328

D.P.R.

5 giugno 2001,

n. 328

DEFINIZIONE DELLE COMPETENZE PROFESSIONALI

Art. 31 (Attività professionali)

1. Formano oggetto dell'attività professionale degli iscritti nella sez. A

[…]

b)analisi biologiche (urine, essudati, escrementi, sangue),

sierologiche, immunologiche, istologiche, di gravidanza,

metaboliche e genetiche;

[…]

d) identificazione di agenti patogeni (infettanti ed infestanti)

dell'uomo […]

h) problemi di genetica dell'uomo […]

2. Formano oggetto dell'attività professionale degli iscritti nella sez. B

a) procedure analitico-strumentali connesse alle indagini

biologiche;

b) procedure tecnico-analitiche in ambito biotecnologico,

biomolecolare, biomedico anche finalizzate ad attività di ricerca;

[…]

d) procedure tecnico-analitiche in ambito chimico-fisico,

biochimico, microbiologico, tossicologico, farmacologico e di

genetica;

e) procedure di controllo di qualità.

[…]

Il laureato triennale iscritto all’Ordine dei Biologi sez.B in

applicazione all’Art.31 del DPR 328/01, può svolgere attività

professionale nel ruolo tecnico – esecutivo nei laboratori di

analisi del settore agro-alimentare,ambientale, della ricerca e

dell’industria del farmaco ecc…

D.P.R.

5 giugno 2001,

n. 328

Il lI laureato triennale iscritto all’Ordine dei Biologi nella Sez. B

non può firmare i referti o i rapporti di prova in quanto di

competenza del Dirigente (iscritto nella Sez. A).

Non nei laboratori di analisi cliniche, dove è prevista la figura del

tecnico di laboratorio biosanitario con laurea triennale

conseguita presso la facoltà di medicina.

L’Art .8 (norma transitoria) prevede che il Biologo Junior in

possesso del diploma universitario possa svolgere la sua attività

professionale nei laboratori di analisi cliniche.

Accesso alla Sanità Pubblica

elenco delle specializzazioni riconosciute dal Ministero della Salute

per l’accesso ai concorsi pubblici.

DMS 30/1/98 e DMS 31/1/98 e successive modifiche

Requisito obbligatorio : possesso della specializzazione

DMS

30 gennaio 1998

Tabelle relative

alle discipline

equipollenti

previste dalla

normativa

regolamentare

per l’accesso al

secondo livello

dirigenziale per il

personale del

ruolo sanitario del

SSN

AREA DELLA MEDICINA DIAGNOSTICA E DEI SERVIZI

ANATOMIA PATOLOGICA

BIOCHIMICA CLINICA

FARMACOLOGIA E TOSSICOLOGIA CLINICA

LABORATORIO DI GENETICA MEDICA

MEDICINA TRASFUSIONALE

MICROBIOLOGIA E VIROLOGIA

PATOLOGIA CLINICA

(LABORATORIO DI ANALISI CHIMICO-CLINICHE E MICROBIOLOGIA)

Analisi chimico- cliniche Genetica

Radiommunologia, immunometria

Medicina trasfusionale

Procreazione Assistita

Igiene

Epidemiologia

Tossicologia

Biologia molecolare

Anatomia patologica

Nutrizione e alimenti

D.P.R.

10 dicembre

1997,

n. 484

Regolamento

recante la

determinazione

dei requisiti per

l’accesso alla

direzione

sanitaria

aziendale e dei

requisiti e dei

criteri per

l’accesso al

secondo livello

dirigenziale per il

personale del

ruolo sanitario del

SSN

Art. 4 Discipline

E) Categoria professionale dei biologi

Biochimica clinica

ricompresa nell’area della Medicina diagnostica e dei servizi

Laboratorio di genetica medica

ricompresa nell’area della Medicina diagnostica e dei servizi

Microbiologia e virologia

ricompresa nell’area della Medicina diagnostica e dei servizi

Patologia clinica

ricompresa nell’area della Medicina diagnostica e dei servizi

Igiene degli alimenti e della nutrizione

ricompresa nell’area di sanità pubblica

DMS

30 gennaio 1998

Tabelle relative

alle discipline

equipollenti

previste dalla

normativa

regolamentare

per l’accesso al

secondo livello

dirigenziale per il

personale del

ruolo sanitario del

SSN

DMS

23 Marzo 2018

Modifica al

decreto 30

gennaio 1998 e

successive

modificazioni

AREA DELLA MEDICINA DIAGNOSTICA E DEI SERVIZI

Esempio: Biochimica Clinica

SCUOLE EQUIPOLLENTI:

Chimica biologica o biochimica

Biochimica e chimica clinica

Biologia clinica

Semeiotica e diagnostica

di laboratorio

Medici laboratoristi

Settore laboratorista

Biochimica clinica - scuole

equipollenti:

Farmacologia medica;

Farmacologia e tossicologia

clinica;

Patologia clinica e biochimica

clinica

Settori e medici laboratoristi

ospedalieri

Analisi cliniche di laboratorio

Analisi chimico-cliniche

Patologia clinica

Biochimica analitica

Farmacologia

Farmacologia applicata

Allergologia e immunologia

clinica

Patologia generale

AREA DELLA MEDICINA DIAGNOSTICA E DEI SERVIZI

Scuola di Specializzazione patologia clinica e biochimica clinica

Obiettivi formativi di base

Acquisire le conoscenze generali anche di tipo metodologico di

chimica analitica, chimica biologica, biologia molecolare,

patologia generale e statistica sanitaria

Acquisire competenze nell'uso della biologia cellulare e

molecolare applicate ai sistemi automatizzati di biochimica

clinica e patologia diagnostica clinica

Acquisire competenze nell'ambito dell'oncologia, immunologia e

immunopatologia

Acquisire competenze teoriche pratiche e manageriali per

conseguire la capacità decisionali ed organizzative in medicina

di laboratorio

SERVIZIO DI

MEDICINA DI LABORATORIO:

Aspetti organizzativi

e ruolo del Biologo

SERVIZIO DI DIAGNOSTICA DI DI LABORATORIOD.P.C.M.

10 febbraio 1984

Indirizzo e

coordinamento

dell’attività

amministrativa

delle regioni in

materia di

requisiti minimi di

strutturazione, di

dotazione

strumentale e di

qualificazione

funzionale del

personale dei

presidi che

erogano

prestazioni di

diagnostica di

laboratorio

Art. 2. Identificazione delle strutture

I laboratori di analisi cliniche ai fini del presente provvedimento

sono:

1) i servizi di laboratorio degli ospedali pubblici [….], nonché

quelli degli istituti pubblici di ricovero e cura a carattere

scientifico […]

2) i servizi di laboratorio degli istituti universitari nonché quelli

degli ospedali policlinici universitari […]

3) i laboratori di analisi cliniche dei presidi territoriali delle

U.S.L. ivi compresi i laboratori dei presidi multizonali di

prevenzione che effettuano analisi cliniche;

4) i laboratori di analisi cliniche privati aperti al pubblico.

D.P.C.M.

10 febbraio 1984

Art. 3. Classificazione funzionale

I laboratori di analisi privati aperti al pubblico si distinguono in:

1) laboratori generali di base;

2) laboratori specializzati;

3) laboratori generali di base con settori specializzati.

I laboratori generali di base sono presidi pluridisciplinari che

svolgono indagini diagnostiche di biochimica clinica, di ematologia e

di microbiologia su campioni provenienti da escreti, secreti e prelievi

umani […]. Nei laboratori generali di base

non devono essere impiegate metodiche che utilizzino radioisotopi.

I laboratori specializzati sono strutture destinate a esplicare

indagini diagnostiche ad alto livello tecnologico e professionale nei

settori di: chimica clinica e tossicologica;ematologia;microbiologia e

sieroimmunologia;citoistopatologia;virologia; genetica medica.

SERVIZIO DI DIAGNOSTICA DI DI LABORATORIOD.P.C.M.

10 febbraio 1984

Art. 8. Organico e qualificazione funzionale del personale

L’organico minimo del personale dei laboratori generali di base è

costituito da:

1) un direttore medico o biologo. Entrambi devono essere iscritti

all’albo dell’ordine di appartenenza. essere in possesso della

laurea in medicina e chirurgia e della specializzazione [...] o della

laurea in scienze biologiche e della specializzazione […]

Nel caso che il direttore sia un biologo deve essere compreso tra i

collaboratori un laureato in medicina;

2) un collaboratore laureato in medicina, biologia o chimca;

3) un tecnico di laboratorio diplomato;

4) un ausiliario con mansioni esecutive;

5) un addetto alle attività amministrative.

D.P.C.M.

10 febbraio 1984

Art. 8. Organico e qualificazione funzionale del personale

L’organico minimo del personale dei laboratori specializzati è il

seguente:

a) per i laboratori di analisi chimico-cliniche e tossicologiche il

personale previsto è uguale a quello dei laboratori di base. Il direttore

può essere anche un laureato in chimica iscritto all’albo professionale

dei chimici.

Nel caso che il direttore sia un chimico o un biologo deve essere

compreso tra i collaboratori un laureato in medicina e chirurgia;

b) per i laboratori specializzati in microbiologia e

sieroimmunologia, ematologia e genetica medica, virologia, il

personale previsto è uguale a quello dei laboratori generali di base;

c) per i laboratori specializzati in citoistopatologia il personale

previsto è uguale a quello dei laboratori generali di base. Il direttore

responsabile deve essere un laureato in medicina e chirurgia […]

L’organico dei settori specializzati dei laboratori generali di base deve

prevedere almeno un laureato con i requisiti richiesti per la direzione

della relativa branca specialistica.

Personale del Laboratorio Analisi Cliniche (o biomedico)

Direttore: biologo, chimico o medico con esperienza e formazione Manageriale

supervisione analisi, firma dei risultati e giudizi diagnostici

Registrazione e archiviazione degli esami

Gestione del personale e della sicurezza sul lavoro

Gestione economica

Scelta e approvazione dei sistemi diagnostici

Valutazione costi/benefici dell’aggiornamento tecnologico e/o metodologico

Supervisione del sistema gestione qualità

Dirigente: biologo, chimico o medico, ruolo clinico e manageriale;

Organizzazione attività di laboratorio del settore di competenza

Esecuzione di alcuni esami(es: lettura preparati e loro refertazione)

Verifica ed interpretazione risultati per corretta formulazione del referto

Interazione con il clinico per favorire interpretazione risultati e il loro corretto utilizzo

nel processo diagnostico terapeutico

Controllo e mantenimento della qualità (risultati e processi)

Personale del Laboratorio Analisi Cliniche (o biomedico)

Tecnico sanitario di laboratorio biomedico (TSLB):

figura professionale disciplinata da legge n. 745/1994 (e successive modifiche);

laurea triennale con competenze relative a settori di biochimica, microbiologia,

immunologia, farmacotossicologia, biologia molecolare, ematologia...

funzioni:

Esecuzione delle analisi

Verifica correttezza dei risultati (in accordo con protocolli definiti dai dirigenti

responsabili)

Verifica corretto funzionamento degli strumenti utilizzati e manutenzione delle

apparecchiature

Responsabile esecuzione controlli qualità

Verifica della correttezza tecnica dei risultati forniti

Personale del Laboratorio Analisi Cliniche (o biomedico)

Infermiere:

funzioni:

Esecuzione prelievo ematico

Raccolta campioni biologici

Ritiro e verifica idoneità dei campioni dei pazienti

Personale ausiliario e amministrativo:

funzioni:

Accettazione campioni

Controllo e trasposto campioni

Gestione e consegna referti

BIOSICUREZZA IN LABORATORIO

Manuale di biosicurezza pubblicato da OMS

Compendio di regole pratiche: manuale operativo di sicurezza che identifica i rischi

noti e potenziali e specifica le procedute da adottare per eliminare o ridurre tali rischi

Requisiti minimi per i laboratori a qualsiasi livello di biosicurezza,

diretti alla lavorazione con tutti i microrganismi

Responsabilità del Direttore e del Preposto a sicurezza del laboratorio

BIOSICUREZZA IN LABORATORIO

Manuale di biosicurezza pubblicato da OMS

Progettazione del laboratorio e attrezzature

Attrezzature di laboratorio (scelta attrezzature secondo criteri per eliminare o

ridurre contatto operatore e materiale biologico, rispondenti a requisiti

di resistenza strutturali..)

Sorveglianza sanitaria (prevenire e individuare malattie occupazionali)

Formazione e addestramento (su procedure e buona pratica di laboratorio;

rischi da inalazione per generazione aerosol da strisci, centrifugazione,

apertura contenitori, manipolazione campioni)

Trattamento dei rifiuti (smaltimento taglienti contaminati, rifiuti non contaminati)

Decontaminazione (sterilizzazione in autoclave a vapore)

Rischi da attrezzature, chimico, elettrico, da incendio e da radiazioni

Accesso al laboratorio (esporre simbolo di rischio biologico, vietare accesso a

non autorizzati)

Dispositivi individuali di protezione (camici, quanti, occhiali di sicurezza, visiere)

Procedure (per versamenti accidentali di liquidi, divieto di pipettare a bocca..)

Aree di lavoro (ordine e pulizia del laboratorio..)

Gestione della biosicurezza (il direttore ha responsabilità di assicurare l’adozione

del piano di sicurezza)

Il laboratorio esegue analisi cliniche

(biologiche,microbiologiche,sierologiche,

immunoematologiche, ematologiche, biofisiche, citologiche)

di materiale derivato dal corpo umano per:

ricavare informazioni per la diagnosi e la prevenzione e il

trattamento di patologie

Valutare lo stato di salute del paziente

spesso ordinate in pannelli o profili per una migliore valutazione dello

stato del paziente

Es: pannello epatico , pannello elettroliti, profilo lipidico...ecc

Le analisi comprendono le procedure per la determinazione, la misura o

la descrizione della presenza o assenza di varie sostanze o organismi

nel corpo

ESAMI DI LABORATORIO (esempi)

Pannello metabolico: valutazione stato generale del paziente

Funzionalità epatica (AST, ALT), renale, (creatinina) equilibrio elettrolitico (Na, Cl, K),

proteine (albumina), glicemia...

Biomarcatori neoplasia (informazioni clinicamente utili da associare ad altri

esami, per diagnosi, prognosi, monitoraggio terapie, eventuali recidive, es: PSA)

Valutazione funzione emostatica

(PT, PTT per la valutazione efficacia via estrinseca ed intrinseca della coagulazione)

Valutazione patologie ematologiche (esame emocromocitometrico ,diagnostica

anemie;)

Indagini colturali e sierologiche (diagnosi malattie infettive, virali (HIV, epatiti virali) e

batteriche (identificazione organismi patogeni nelle alte e basse vie respiratorie, vie

urinarie...)

Immunoematologia (determinazione gruppi sanguigni)

Diagnosi patologie autoimmuni (celiachia): ricerca auto-anticorpi (Ab anti endomisio)

Diagnosi malattie endocrine (squilibri o disfunzioni ormonali): dosaggi ormoni (TSH)

Norma ISO 15189

“ GESTIONE DELLA QUALITA’ NEI LABORATORI DI ANALISI CLINICHE”

TERMINI E DEFINIZIONI

Procedure pre-analitiche

fasi che comprendono, ordinate cronologicamente:

La richiesta clinica

l’accettazione delle analisi

La preparazione del paziente

La raccolta del campione primario

Trasposto al/in laboratorio

Inizio dei procedimenti di analisi

Procedure post-analitiche

fasi che comprendono, ordinate cronologicamente:

La stesura e l’interpretazione dei risultati delle analisi da parte del laboratorio clinico

La refertazione

La conservazione dei campioni

La trasmissione dei risultati delle analisi

l’eliminazione del campione primario

Procedura analitica

Serie di operazioni, descritte in maniera

specifica, utilizzate nell’esecuzione

di particolari analisi, in accordo ad un

metodo stabilito

FASE PREANALITICA:

Identificazione del

paziente

Valutazione della richiesta

delle analisi

Prelievo e raccolta del

materiale biologico

Trasporto del campione in

laboratorio

Accettazione del campione

Preparazione del

campione prima

dell’analisi

FASE ANALITICA:

Esecuzione delle analisi

Misura e calcolo dei risultati

FASE POSTANALITICA:

Validazione dei risultati

Analisi della loro coerenza

Refertazione

Invio del referto al medico richiedente

valutazione dell’idoneità del campione (raccolta, trasporto, corretta quantità)

60 -70% DEGLI ERRORI DI LABORATORIO

Fase critica:

PRELIEVO EMATICO: errori identificativi, campioni emolitici, insufficienti, coagulati,

non idonei per tipo o quantità

STATO DEL PAZIENTE: esercizio fisico, stress, dieta, effetti posturali, comorbidità...

FASE PREANALITICA

FASE ANALITICA

utilizzo di metodiche e strumentazioni adeguate al tipo di analisi richiesta

Performance o attendibilità di un metodo analitico: è la qualità che lo caratterizza

Determinata da:

precisione (concordanza tra i risultati di una serie di misure ottenute con stesso

metodo sullo stesso campione)

Accuratezza (grado di concordanza tra il valore medio trovato e il valore vero

(conosciuto)

Sensibilità (attitudine del metodo a dosare piccole quantità della sostanza)

Specificità (proprietà di un metodo solo e interamente la sostanza studiata)

Dipendono da esecuzione analitica

(organizzazione ed efficienza operativa del laboratorio)Dipendono da metodo

FASE ANALITICA

partecipazione a valutazioni inter-laboratorio o a valutazione esterne di Qualità (VEQ)

(determinazione dell’accuratezza delle procedure): analisi di campioni inviati da

laboratori esterni o da organismi regionali o internazionali

Sistema di controllo di qualità interno: SISTEMA OPERATIVO per individuare gli

errori in fase analitica (controlla l’attendibilità di un metodo)

taratura/calibrazione dei sistemi analitici e verifica della precisione

Errori sistemici: si ripetono quando si fa lo stesso tipo di analisi;

causa conosciuta o individuabile, eliminabile (scarsa sensibilità o specificità di un

metodo, manualità errata dell’operatore….)

Errori casuali: inevitabili, di piccola entità, imputabili a condizioni operative

FASE POSTANALITICA

deve contenere tutte le informazioni necessarie

(dati anagrafici paziente, data del prelievo, tipo di campione, tipo di esame, metodologia

diagnostica, risultati, valori di riferimento con esplicita unità di misura,

nome indirizzo e identificazione del laboratorio che ha eseguito il test)

Fase di refertazione dell’esito dell’analisi

Il biologo valuta tale esito in corrispondenza con i parametri riconosciuti come

standard e ne verifica la plausibilità clinica

Il referto risultante deve essere facilmente comprensibile e interpretabile

Il referto di laboratorio è caratterizzato da aspetti interpretativi, frutto di un complesso

processo che richiede competenze professionali sia tecniche che cliniche, in grado

fornire informazioni utili alla cura del paziente

eseguiti da laboratori di analisi, pubblici o privati, localizzati all’interno di

cliniche/ospedali o indipendenti. “In alcuni casi le analisi e le interpretazioni

possono provenire da laboratori esterni a quello che redige i referti e questa

informazione deve essere chiaramente riportata” (NORMA ISO15189)

FASE POSTANALITICA

Il referto deve essere consegnato all’utilizzatore nell’intervallo di tempo concordato

indicatore di qualità Turn Around Time (T.A.T.): tempo che intercorre dalla

richiesta dell’esame alla refertazione del risultato

può essere inteso come il tempo che intercorre dalla ricezione del campione da

parte del laboratorio alla refertazione dei risultati.

TAT rappresenta un metro di valutazione. Migliorare il tempo di risposta di alcuni

test chiave ha un impatto positivo sia sui pazienti che sul sistema sanitario

(diagnosi più rapida e la riduzione dei tempi di ospedalizzazione)

Eliminare o ridurre notevolmente la complessità delle fasi

delle attività di laboratorio per eliminare

o ridurre la possibilità di errore

eliminare un’ampia serie di operazioni ad elevato rischio

(d’errore e biologico), valorizzando le risorse umane

utilizzo di combinazioni di strumentazioni,

programmi informatici o altri processi atti sostituire,

affiancare o estendere il contributo e la capacità dell’uomo

di portare a termine un determinato processo,

al fine di incrementare la produttività e l’efficienza del servizio*.

*“L’automazione della fase preanalitica” G.Lippi et al., biochimica clinica, 2007, vol. 31, n. 2

AUTOMAZIONE DI LABORATORIO

Strumenti in grado di meccanizzare processi

di accettazione, separazione, aliquotazione, distribuzione

Sistemi di automazione:

Reattivi pronti all’uso (enzimi, coenzimi, tamponi): abbattimento del

lavoro manuale di preparazione

Analizzatori con hardware e software complessi;

(ampio pannello di esami su singola strumentazione analitica)

mini sistemi per determinazioni di base (ad es emogas) dirette a letto del

paziente definite “POCT” (“point-of-caretesting”)

da destinare all’emergenza ed in generale al di fuori del laboratorio

(in sala operatoria, in ambulatorio, in corsia,…);

settori manuali o solo parzialmente automatizzati

(anatomia-citologia, batteriologia,etc.)

automazione globale di tutti i processi analitici del laboratorio (fasi

pre-analitica, analitica, e post-analitica)

automazione modulare per singole aree analitiche o “isole”

Principali tecniche analitiche

nella diagnostica clinica e

microbiologica

Benedetta Cremonesi

le tecniche di Laboratorio si avvalgono delle più svariate proprietà chimiche,

fisiche e sono state sviluppate a scopo diagnostico presentando caratteristiche di

specificità e sensibilità

la scelta del tipo di analisi dipende dalle caratteristiche del campione e dell’analita

In campo clinico vengono utilizzate sia a scopo qualitativo che quantitativo per la

determinazione di microrganismi patogeni o molecole (ormoni, proteine,

oncoproteine, anticorpi, citochine e marcatori di danno d'organo, farmaci, droghe

d’abuso)

SPETTROFOTOMETRIA

La fotometria è il processo che determina la quantità di luce assorbita da

atomi, molecole e viene usata per la stima quantitativa di composti.

Spettrofotometro:

strumento basilare nella chimica clinica ; rileva l'effetto dell'energia raggiante

su atomi e molecole su lunghezze d'onda diverse da quelle rilevate dall'occhio

umano (400 -700 nm), per esempio U.V. (200 - 400 nm)

SPETTROFOTOMETRIA

monocromatore o dei filtri: seleziona la lunghezza d’onda desiderata (in base a

proprietà sostanza da misurare) diretta verso cuvetta del campione

fonte luminosa (lampada): genera luce con un ampia gamma di lunghezze d’onda

Cuvetta: contenitore in materiale trasparente che contiene le soluzioni da sottoporre

ad analisi con metodi ottici

Fotorilevatore: permette la misurazione della luce

SPETTROFOTOMETRIA

La luce può essere assorbita da una sostanza disciolta nella soluzione (assorbanza)

diffusa o rifratta da particelle sospese nella soluzione (turbidimetria o nefelometria)

emessa da una sostanza che assorbe la luce su una lunghezza d'onda e l'emette su

un'altra lunghezza d'onda (fluorescenza)

la concentrazione di una determinata sostanza in soluzione,

partendo dai valori di assorbanza si ottiene applicando legge di Beer,

confrontando le letture dei campioni con letture di standard a

concentrazioni note o estrapolando la concentrazione da curve

di taratura ottenute con soluzioni di riferimento.

luce assorbita: differenza tra luce emessa

dalla fonte luminosa (lo) e luce che

raggiunge il fotorilevatore (ls).

I composti che non hanno una colorazione visibile

spesso assorbono la luce nella gamma dell'ultravioletto

Aumento quantità sostanza nella soluzione = riduzione quantità relativa di luce che

passa attraverso la soluzione e raggiunge il fotorilevatore. la riduzione è definita

assorbanza

Legge di Beer:

descrive la relazione

tra concentrazione e luce assorbita

lo

ls

ASSORBANZA

maggiore concentrazione dell'analita = maggior n° particelle che impediscono il

passaggio della luce attraverso la soluzione: aumenta la quantità di luce riflessa

Metodi basati sulla formazione di particelle non solubili che interferiscono con il

passaggio della luce attraverso la soluzione.

L'analita reagisce con un reagente aggiunto per produrre particelle non solubili,

sospese nella soluzione. Quando la luce colpisce tali particelle, una parte viene riflessa

in varie direzioni

In nefelometria, il rilevatore viene posizionato angolato rispetto al percorso del fascio

luminoso, per evitare il rilevamento della luce che passa attraverso il campione.

fotorilevatoreSorgente

luminosa

NEFELOMETRIA

Spesso questi metodi utilizzano anticorpi :

analisi immunometrica

(immunoturbidimetria e

immunonefelometria)

In turbidimetria, il rilevatore viene posizionato in asse con la luce incidente e la luce

rilevata diminuisce con l'aumentare delle particelle di analita presenti; viene rilevata la

luce diffusa dalle particelle.

Gli anticorpi presenti nei reagenti provocano la formazione di complessi o lattici

con le molecole dell'analita che migliorano la riflessione della luce, facendo

aumentare il segnale analitico misurato

I metodi turbidimetrico e nefelometrico impiegati nella misura di proteine

TURBIDIMETRIA

Alcuni tipi di strutture chimiche sono in grado di assorbire la luce su una lunghezza

d'onda e di emettere luce su un'altra lunghezza d'onda (fluorescenti o fluorofori);

la luce incidente è su una lunghezza d'onda più corta e a un'energia più elevata

della luce emessa.

rilevatore posizionato a un angolo di 90° rispetto alla luce incidente, rileva solo la luce

emessa; La concentrazione del composto fluorescente è direttamente proporzionale

alla quantità di luce emessa dal campione

Gli analiti di interesse in chimica clinica non sono fluorescenti per natura, per la

loro rilevazione vengono incorporate delle molecole fluorescenti come reagenti

E alta E bassa

λ minoreλ maggiore

Cuvetta con fluoroforo

FLUORESCENZA

per la determinazione di substrati

(glucosio, urea, colesterolo con la metodica definita“end point”

(che avvengono alla fine della reazione)

l'intera quantità di analita viene convertita in prodotto

indicate per le reazioni chimiche che si

completano in tempi relativamente brevi

Se il metodo misura la creazione di

un prodotto, l'assorbanza risulta

maggiore all'endpoint rispetto al

punto iniziale

La fotometria trova applicazione nei Laboratori di chimica clinica

enzima catalizza la conversione di reagenti (substrati) in prodotto: la quantità di

prodotto all'endpoint rifletterà la quantità di substrato presente

La metodologia cinetica si può anche

utilizzare per misurare analiti diversi dagli

enzimi (quando reazione raggiunge molto

lentamente l'endpoint)

Per la determinazione di enzimi quali transaminasi, fosfatasi alcalina, LDH …

con la metodica“rate” (che valuta le variazioni di assorbimento nell'unità di

tempo).

la misurazione della velocità del cambiamento nel tempo del prodotto che si

forma

l'attività di un enzima si determina misurando la cinetica della reazione invece della

reazione endpoint.

Esteri del colesterolo + H2O colesterolo + RCOOH

Colesterolo + O2 colest-4-en-3-one + H2O2

2 H2O2 + 4-AAP + fenolo colorante chinoneiminico + 4 H2O

ESEMPIO end point: DETERMINAZIONE COLESTEROLO

Metodo enzimatico colorimetrico

Gli esteri del colesterolo vengono dissociati per azione della colesterolo esterasi (CE),

formando colesterolo libero e acidi grassi.

la colesterolo ossidasi catalizza l'ossidazione del colesterolo, formando

colest-4-en-3-one e perossido d'idrogeno

In presenza di perossidasi, il perossido d’idrogeno formatosi influenza

sull’accoppiamento ossidativo del fenolo e del 4-aminofenazone, producendo un

colorante chinoneiminico rosso.

L’intensità di colore del colorante è direttamente proporzionale a concentrazione di

colesterolo. Viene determinata misurando l’aumento dell’assorbanza.

IMMUNODOSAGGI

tecniche di comune utilizzo sia in campo clinico che nella ricerca

Caratterizzate da elevata sensibilità e specificità

quantificazione della concentrazione di antigene

Costituenti degli immunodosaggi:

l'antigene (sostanza da misurare, calibratore..) il reattivo anticorpale

Il tracciante (segnala la reazione Ag-Ab grazie a legame con marcatore

(enzima, fluoroforo..)

curva standard (per attribuzione«quantità» al segnale emesso da tracciante)

metodo diretto : per quantificazione di un Ag (proteina plasmatica oppure

una componente microbica)

microbiologia clinica: valutazione siero-conversione o infezione pregressa

tecniche di immunofluorescenza o di ELISA

metodo indiretto: ricerca e la quantificazione degli Ab specifici

Immunodosaggi diretti e indiretti

metodi competitivi l'analita (Ag) compete con un tracciante costituito da un

antigene marcato (Ag*) per formare un immunocomplesso con un Ab specifico

presente in quantità limitata

La misura del segnale (Ab-Ag*) è in genere inversamente proporzionale

all'analita presente nel campione.

Immunodosaggi competitivi e non competitivi

metodi non competitivi: l'analita (Ag) dosato mediante l'utilizzo di

due diversi anticorpi, presenti in eccesso, specifici per due diversi epitopi

dello stesso antigene

Un anticorpo è marcato (Ab*) e l'altro è legato ad una“fase solida”

La misura del segnale (Ab*-Ag-Ab fase solida) è direttamente

proporzionale all'analita presente nel campione.

I metodi non competitivi sono più sensibili dei metodi competitivi poiché

in prossimità dello zero un piccolo incremento di segnale è più rilevabile

rispetto ad un piccolo decremento.

metodi “sandwich”: l'antigene è legato fra due anticorpi.

immunodosaggi omogenei ed eterogenei

Omogenei: non richiedono la separazione dell'immunocomplesso dalla

frazione non legata per la lettura del segnale; sono più semplici e veloci

utilizzati in genere per il dosaggio di piccole molecole come farmaci e droghe d'abuso

Eterogenei: richiedono la separazione dell'immunocomplesso ottenuta

con un Ab o Ag adeso ad una fase solida per lettura segnale

Alla separazione segue segue l'aggiunta del reagente

complementare incubazione blocco della reazione lettura.

utilizzato soprattutto in

sierologia infettiva ed autoimmunità

ELISAELISA o Enzyme Linked Immunosorbant Assay

tecnica molto utilizzata nella diagnostica di Laboratorio.

immunodosaggio eterogeneo, sandwich

o competitivo, in cui

un anticorpo o un antigene sono

immobilizzati ad una fase solida

(micropiastra)

elevata sensibilità: una sola molecola di enzima può reagire con numerose

molecole di substrato, determinando, in presenza di titoli anticorpali modesti,

una reazione colorimetrica amplificata.

Chemioluminescenza: emissione di luce che deriva da una reazione chimica

molecole che, a causa della propria struttura, quando reagiscono con altre

molecole producono luce invece che calore.

anni '80 e '90: notevoli progressi nella sensibilità, specificità dei dosaggi, nella

loro automazione con introduzione di altre tecnologie:

FIA (Fluorescent ImmunoAssay)

CLIA (ChemiLuminescent ImmunoAssay)

alcuni metodi immunologici utilizzano molecola chemiluminescente per la

determinazione di ormoni e marker tumorali

Elettrochemiluminescenza: tecnica variante con

generazione del segnale chemioluminescente mediante

pulsazioni trasmesse alla miscela con una corrente

elettrica, che sostituisce la reazione chimica.

1. Un Ab specifico si lega all’analita (Ag) presente nel campione

2. Rimozione degli Ab non legati ad Ag

3. Aggiunta di un secondo Ab specifico marcato con molecola chemiluminescente

4. Formazione legame con complesso creato dal primo Ab

5. Aggiunta alla miscela di reazione una sostanza chimica

6. Creazione di un segnale chemiluminescente proporzionale a quantità di Ag

Ab monoclonale specifico

biotinilato anti-TSH

Ab marcato con

complesso di

rutenio RuTSH

1a incubazione

ImmunoAssay in ElettroChemiLuminescenza “ECLIA”

Es:Dosaggio Ormone Tireostimolante (TSH)

complesso sandwich

Microparticelle

paramagnetiche coattate con

streptavidina

il complesso si lega alla fase solida mediante

l’interazione biotina-streptavidina.

2a incubazione

+-

Elettrodo e magnete

ECL

Luce prodotta direttamente proporzionale a concentrazione dell’analita

applicando una tensione all’elettrodo, si induce

emissione chemiluminescente che viene misurata

mediante fotomoltiplicatore.

miscela di reazione: aspirata nella cella di misura, le

microparticelle vengono attratte magneticamente alla

superficiedell’elettrodo

Segue rimozione delle molecole non legate

(soluzione di lavaggio)

I risultati vengono calcolati in base ad una curva di calibrazione

generata in modo specifico per lo strumento in uso

si utilizzano una serie di soluzioni che contengono l'analita in concentrazioni

note e si osserva il segnale prodotto a ogni livello di concentrazione

scopo curva di calibrazione:

stabilire relazione tra la concentrazione dell'analita e segnale misurato

METODICHE IMMUNOLOGICHE

Identificazione e quantificazione di Ag specifici da una soluzione

Agglutinazioneanticorpo è in grado di esplicare azione agglutinante quando Ag

è costituito da elementi corpuscolari(es. globuli rossi o batteri)

aggregazione e alla sedimentazione di un antigene dopo reazione con l’anticorpo

identificazione di varie specie batteriche e determinazione gruppi sanguigni

Metodo utilizzato per l’analisi delle proteine del siero

stadi successivi:

1) elettroforesi della miscela antigenica in un gel: separazione dei singoli componenti

in base a mobilità elettroforetica

2) deposito di un antisiero, specifico per alcune o tutte le componenti

proteiche, in una scanalatura laterale parallela alla direzione della migrazione

3) Diffusione dell’antisiero e formazione delle bande di precipitazione

METODICHE IMMUNOLOGICHE

Immunoelettroforesi

ricerca di anticorpi o di antigeni utilizzata in microbiologia

METODICHE IMMUNOLOGICHE

Fissazione del complemento

reazione immunologica basata su attivazione del complemento

Ia formazione di un immunocomplesso (ag e Ab (IgG o IgM) attiva cascata

enzimatica con formazione di proteina che lisa la cellula presentante Ag

Utilizzo di due sistemi:

1. ag noto + siero ignoto (ricerca di Ab specifici)

2. GR di montone e antisiero anti-GR di montone (sistema emolitico)

Formazione di

immunocomplesso Ag-Ab:

il sistema emolitico si deposita

su fondo provetta o micropiastra

(reazione positiva)

Assenza immunocomplesso Ag-Ab:

il complemento si lega al secondo

sistema aggiunto al termine 1^

incubazione,

con lisi dei GR e liberazione di Hb

ELETTROFORESI

tecnica analitica e separativa basata movimento di particelle (ioni, molecole)

immerse in un fluido per effetto di un campo elettrico applicato mediante una

coppia di elettrodi catodo (assume carica negativa) e anodo (carica positiva)

Utilizzo di tampone a pH alcalino che conferisce alle molecole proteiche una carica

negativa rendendole solubili senza sottoporle a denaturazione

le particelle si muovono verso l'elettrodo avente carica opposta rispetto alla

carica della particella

Velocità di migrazione (mobilità elettroforetica) legata a diversi fattori: massa,

dimensione,carica e forma delle particelle, natura del mezzo e da campo

elettrico applicato

-COOH + OH- → -COO- + H2O

Elettroforesi proteine del siero

iniezione del campione nei capillari è

effettuata all’anodo per aspirazione

la lettura diretta delle proteine viene

effettuata a 200 nm all’estremità catodica

del capillare

Vantaggio: automazione completa dell’analisi, separazioni rapide e buona risoluzione

metodologia intermedia tra l’elettroforesi zonale classica su supporto solido e la

cromatografia in fase liquida

la separazione in funzione del pH dell’elettrolita

e del flusso elettro endo-osmotico (fenomeno

dovuto a ionizzazione della silice del capillare).

Elettroforesi capillare

sviluppata parallelamente tecniche elettroforetiche su diversi supporti ( gel d’agarosio)

tecnica di separazione elettrocinetica effettuata in un capillare riempito con un

tampone composto da elettroliti.

l’ordine di migrazione delle proteine

sieriche è il seguente :

gamma globuline, beta-2 globuline, beta-1

globuline, alfa-2 globuline, alfa-1 globuline

e albumina.

CROMATOGRAFIA

tecnica separativa e analitica : i componenti di una miscela tendono a ripartirsi in

modo diverso tra due fasi, in funzione della loro affinità con ciascuna di esse

fase rimane fissa (la fase stazionaria) un solido o un gel

fase, liquida o gassosa, (la fase mobile) fluisce su fase fissa trascinando con sé

in quantità maggiore i componenti della miscela che più risultano affini ad essa.

il rivelatore posto in fondo all'apparecchio

registra il passaggio di una sostanza eluita,

elabora i dati su di un cromatogramma

Ogni volta che una sostanza viene

rivelata,il cromatogramma registra un

picco più o meno alto a seconda della sua

concentrazione.

Cromatografia liquida ad alta prestazione (High Performance Liquid

Chromatography, un tempo nota come high-pressure liquid chromatography) o HPLC

Alla fine della colonna è

applicato un rilevatore e un

calcolatore che permettono

un'analisi in continuo

dell'uscita della colonna

quantificazione e/o

identificazione di sostanze

iniettate tramite specifico

cromatogramma.

è un tipo di cromatografia liquida che rappresenta l'evoluzione strumentale della

cromatografia in fase liquida su colonna classica

Il campione iniettato all'inizio della colonna cromatografica dove è "spinto"

attraverso la fase stazionaria dalla fase mobile applicando pressioni dell'ordine

delle centinaia di atmosfere

separazione e quantificazione emoglobina (es. dosaggio emoglobina glicata)

Le emoglobine a carica + sono

separate da una fase stazionaria a

carica –

nella colonna

I cationi nella fase mobile (tamponi

con incremento della forza ionica)

competono con le emoglobine

assorbite spingendole all’esterno

Le frazioni sono determinate

otticamente dal rilevatore

tecnologia che consente di rilevare, identificare e contare specifiche cellule

presenti nel circolo ematico, midollo osseo, fluidi corporei (CSF) o cellule tumorali.

CITOFLUORIMETRIA

Pretrattamento del campione

con coloranti specifici (fluorocromi legati ad

Ab monoclonali diretti contro particolari Ag

cellulari

nella camera di flusso le cellule risultano

organizzate in fila, una dietro l'altra.

Il flusso di cellule viene posto davanti ad un

rilevatore, che analizza ciascuna cellula ad

una velocità di centinaia a migliaia di cellule

per secondo

Il laser colpisce le cellule presenti nel

flusso, generando per ciascuna di esse

uno scatter caratteristico e dipendente

dalle caratteristiche della stessa.

Le caratteristiche possono essere fisiche (dimensione e complessità cellulare) o

possono dipendere dal segnale generato dal colorante (il fluorocromo) intercettato dal

laser.

La combinazione di queste informazioni genera un profilo

caratteristico per ciascuna cellula presente all'interno del campione

Il segnale rilevato dai rilevatori (o detector) viene amplificato (dai fotomoltiplicatori) e

inviato al computer. Qui viene convertito in formato digitale e mostrato sul computer o

stampato; i dati sono mostrati sotto forma di grafici (citogrammi)

Applicazione: esame emocromocitometrico differenziazione leucocitaria

Campione normale Leucemia mieloide acuta

Metodiche di BIOLOGIA MOLECOLARE

Il DNA e l'RNA rappresentano il genoma ed il trascrittoma degli organismi e la loro

manipolazione permette una precisa e rapida valutazione sia dei geni che della loro

espressione

Ibridazione Fluorescente in Situ (Fluorescence in situ hybridization; FISH)

test molecolare che utilizza delle sonde fluorescenti

per valutare i geni e/o il DNA nei cromosomi

Nella diagnostica prenatale: determinazione dell’assetto cromosomico di cellule

embrionali su nuclei interfasici (diagnosi di aneuoploidie)

nella diagnostica di Laboratorio in particolare nei campi della Genetica medica

e nella Microbiologia

La reazione a catena della polimerasi o PCR (Polymerase Chain Reaction)

Le sonde si legano alle regioni cromosomiche per

cui presentano omologia, ed eccitate da lampade

che emettono luce a diverse lunghezze

d'onda, emettono un segnale osservabile al

microscopio a fluorescenza,

di colore diverso per ciascun marcatore

FISH

Cellule fissate su vetrini da microscopia

e fatte reagire con una soluzione

contenente una serie di sonde di DNA marcate

con fluorocromi diversi, con

sequenza complementare specifica alle regioni

cromosomiche di interesse

La sonda rileva la sequenza genica

anomala BCR-ABL 1 originata dalla

traslocazione di parte del cromosoma 22

(BCR, colore verde) e del cromosoma 9

(ABL1, colore rosso).

aree gialle: zone nelle quali è presente il

gene di fusione (il colore rosso e verde si

sovrappongono generando il colore giallo).

Identificazione di cromosomi sovrannumerari o mancanti, delezioni (sequenze

geniche perse) o traslocazioni (sequenze geniche spostate in altri cromosomi)

diagnosi di alcune patologie:

Sindrome di Down o trisomia 21 (presenza di cromosomi sovrannumerari )

Leucemia mieloide cronica (traslocazione)

ibridano le regioni adiacenti la sequenza da amplificare

costituiscono innesto per l'enzima DNA polimerasi

(estratto da batteri termofili, funziona ad alte T)

PCR

metodo semplice e rapido per copiare ed amplificare specifiche sequenze di DNA

è necessario conoscere la sequenza di una breve regione di DNA a ciascuna delle

estremità del tratto di interesse

vengono sintetizzati due piccole molecole di DNA complementari dette

primers

miscela di reazione contiene quantità appropriate di 4 deossinucleotidi trifosfati

(monomeri costituenti il DNA)

La reazione di PCR avviene all'interno di termociclatori e consiste nella successione di

più cicli a 3 fasi regolate dalla temperatura:

1. Denaturazione ad elevata temperatura

2. Appaiamento ai primers abbassando la temperatura

3. Sintesi di copie di DNA da parte della polimerasi che lega il DNA grazie

ai primers a partire dai deossinucleotidi liberi nella miscela di reazione.

Una reazione di 30 cicli è in grado di produrre circa un miliardo di copie

del DNA oggetto di studio che può così essere identificato anche se presente

in concentrazioni minime nel campione di partenza.

L'amplificato può essere rilevato tramite una separazione elettroforetica su

gel oppure attraverso sonde marcate

Nel corso degli anni sono state sviluppate diverse varianti di PCR:

NESTED PCR

RT- PCR

MULTIPLEX

PCR

REAL TIME

PCRPCR

prima amplificazione: coppia di primers più esterni al frammento di DNA da

amplificare.

seconda amplificazione: coppia di primers che amplificano un frammento interno

a quello amplificato nella prima reazione

nella seconda PCR il numero di sequenze bersaglio è maggiore e il “background”

è significativamente ridotto.

destinata a ridurre o a eliminare eventuali prodotti aspecifici non desiderati

in seguito all’amplificazione di siti di legame di primer inaspettati ( primers

possono legarsi a regioni di DNA non corrette)

due reazioni successive dello stesso tratto DNA per ottenere sensibilità maggiore;

utilizzata in Microbiologia per dimostrare la presenza del genoma di virus presenti

in bassa concentrazione in un campione biologico.

NESTED PCR

reazione di amplificazione in cui una o più coppie di “primers” specifici per differenti

“target”, nella stesso tubo di reazione amplificazione di molteplici sequenze.

Rapida identificazione di delezioni o duplicazioni in un grande gene

Due coppie di sonde di ibridazione marcate

con un diverso colorante accettore che

emette la fluorescenza a differenti

lunghezze d’onda.

Il segnale emesso viene letto

simultaneamente attraverso canali di

rilevamento fluorimetrico.

MULTIPLEX PCR

amplificazione contemporanea di più segmenti; utile ad esempio per lo studio

delle varianti alleliche nella diagnosi di malattie genetiche.

amplificazione a scopo quantitativo. La miscela di reazione comprende sonde che

sono in grado di emettere segnali di fluorescenza dopo ciascuna amplificazione.

PCR quantitativa: viene utilizzata per quantificare gli acidi nucleici attraverso la

misura della fluorescenza emessa da un fluoroforo (molecola reporter);

amplificazione e quantificazione in unica reazione.

la fluorescenza aumenta in proporzione all’accumulo dei prodotti di PCR,

e si misura in tempo reale durante l’amplificazione (ad ogni ciclo )

REAL TIME PCR

è possibile convertire in DNA un intero trascrittoma (insieme di tutto il trascritto di

una cellula) di uno specifico tessuto di un individuo in una specifica fase del suo

sviluppo.

RNA totale (contenente anche RNA ribosomale) viene incubato con:

un enzima DNA polimerasi RNA-dipendente (trascrittasi inversa o retro-trascrittasi),

deossiribonucleotidi trifosfato (dNTPs), soluzione tampone,

ioni bivalenti Mg2+ (cofattori per polimerasi),sequenze primer

il cDNA generato può essere amplificato mediante PCR classica, oppure essere

quantificato mediante real-time PCR (qPCR).

RT - PCR

sintesi di una molecola di DNA a doppio filamento a partire da uno stampo di RNA

molecola di DNA sintetizzata mediante il processo di retrotrascrizione : cDNA

una tecnica utilizzata in laboratorio per studiare l'espressione genica,

perché consente di sottoporre a ulteriori analisi il cDNA sintetizzato

DIAGNOSI BATTERIOLOGICA (sospetta infezione batterica)

DIAGNOSI DIRETTA: presenza del patogeno su sangue, feci, tamponi, urine, biopsie

Esame microscopico (batterioscopico)

(su campioni a fresco o previa colorazione)

DIAGNOSI BATTERIOLOGICA (sospetta infezione batterica)

DIAGNOSI DIRETTA: presenza del patogeno su sangue, feci, tamponi, urine, biopsie

Esame colturale (isolamento)

Crescita dei microrganismi su sistemi artificiali in vitro denominati terreni di

coltura minimi o di arricchimento per batteri esigenti

Identificazione presuntiva (forma, organizzazione, aspetto coloniale)

DIAGNOSI BATTERIOLOGICA (sospetta infezione batterica)

DIAGNOSI DIRETTA: presenza del patogeno su sangue, feci, tamponi, urine, biopsie

Identificazione finale (definitiva):

biochimica (basata su caratteristiche metaboliche del microrganismo, metodi manuali

o automatizzati)

Immunologica (ricerca di antigeni microbici nel campione)

e molecolare (sonde specifiche a DNA che identificano uno specifico patogeno

Metodo immunologico: ricerca degli

Ag batterici (test di agglutinazione)

Metodo molecolare: ricerca di sequenze

genomiche dell’agente batterico

(PCR, multiplex PCR)

DIAGNOSI BATTERIOLOGICA (sospetta infezione batterica)

DIAGNOSI DIRETTA: presenza del patogeno su sangue, feci, tamponi, urine, biopsie

Una volta eseguita l’identificazione del microrganismo in esame, si procede alla

determinazione della sensibilità/resistenza dell’isolato agli antibiotici

(antibiogramma)

predire successo o fallimento in vivo della terapia antibiotica.

I tests vengono effettuati in vitro, e misurano la risposta (crescita) di un

microrganismo isolato verso un particolare antibiotico/antibiotici.

I risultati di questi tests debbono essere usati per guidare la scelta dell’antibiotico

terapia alla quale contribuiscono anche le informazioni cliniche e l’esperienza

professionale.

Tests di antibiotico-sensibilità

Tecniche per la determinazione in vitro dell’antibiotico-sensibilita’

Metodi manuali (es diffusione in agar) e sistemi automatizzati

Diffusione in agar

1. Allestimento brodocoltura da coltura pura

2. Semina brodocoltura

3. Apposizione dischetti antibiotizzati

4. Incubazione (37°C, 18-24h)

5. Misurazione diametro alone di inibizione

Concentrazione antibiotico

diminuisce con l’aumentare

della distanza dal dischetto

MIC (Concentrazione Minima Inibente) è una misura quantitativa

dell’attività di un antibiotico verso un determinato batterio; la più bassa

concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica visibile

test automatizzato: tecnica della microdiluizione usata per determinare le MIC

card : pozzetto di controllo (solo terreno di coltura

microbiologico); micropozzetti con quantità

predefinite di antibiotici specifici combinati con il

terreno di coltura

Inoculo della card con microrganismo in sospensione

(previa diluizione ad una concentrazione

standardizzata) ed inserimento nell’incubatore/lettore

dello strumento

Lo strumento esegue il monitoraggio della crescita in ciascun pozzetto della card

per un determinato periodo di tempo (24 h) e determina i valori di MIC (o i risultati

dei test) per ciascun antibiotico contenuto nella card.

Esempio referto antibiogramma

Categorie Interpretative:

(Sensibilità, S Intermedia, Resistenza)

individuate da valori di MIC detti breakpoints

(soglia, limite)

S intermedia:

efficacia potrebbe essere più bassa di

quella registrata per gli isolati sensibili

DIAGNOSI INDIRETTA: rileva risposta immune umorale specifica dell’ospite

al patogeno (su siero del paziente)

Metodo immunologico ricerca di Ab verso l’Ag batterico

Test immunoenzimatico (elisa) Saggio in immunofluorescenza

si rende visibile una reazione antigene -

anticorpo marcando uno dei reagenti

fluorocromi

La fluorescenza emessa viene osservata

con un microscopio a luce ultravioletta

( strisci di sospensioni di cellule batteriche

e protozoarie)

DIAGNOSI BATTERIOLOGICA (sospetta infezione batterica)

GRAZIE PER L’ATTENZIONE

Benedetta Cremonesi

DELEGAZIONE REGIONALE LOMBARDIA

CORSO DI PREPARAZIONE

ALL’ESAME DI STATO PER L’ABILITAZIONE

ALLA PROFESSIONE DI BIOLOGO (Sez.A-Sez.B))