Date post: | 10-Feb-2017 |
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Diagnostica della Malattia di Pompe
(Glicogenosi tipo II)
Dott.ssa Angela AmatiServizio di NeurofisiopatologiaAzienda Ospedaliera-Universitaria Policlinico di Bari
ESAMI DI LABORATORIO
– Dosaggio del CK• Bambini: valore aumentato (< 10x);
• Adolescenti e adulti (normale o lievemente
aumentato (5%);
– Dosaggio dell’attività enzimatica dell’alfa
glucosidasi acida;
MALTASI ACIDA(alfa-glucosidasi acida)
• enzima lisosomiale;
•lavora ad un pH compreso
tra 4 e 5;
•dotata di attività alfa-
glucosidasica→può
idrolizzare completamente
il glicogeno in glucosio;
•è il solo enzima
degradativo del glicogeno
presente nei lisososmi;
•è codificato dal gene
GAA;
L’α-1,4-glucosidasi acida
– Localizzazione: presente in tutti i tessuti
– Localizzazione subcellulare: lisosomiale
– Meccanismo d’azione:
• Idrolizzazione lineare dei legami α1-4 glucosidici dei carboidrati
• Il sito catalitico dell’enzima: Asp-518
– Effetti delle mutazioni dell’α-1,4-glucosidasi acida: varie
• Enzima assente: nella forma infantile;
• Enzima e attività proporzionalmente ridotta: nella forma adulta;
• Enzima presente ma attività catalitica ridotta: nelle forme infantili,
giovanili e adulte;
PATOGENESI DELLA MALATTIA DI POMPE
• La GAA è essenziale per la degradazione del glicogeno lisosomiale
• Il deficit causa accumulo e dilatazione
Raben N, Plotz P, Byrne BJ. Acid alfa-glucosidase deficiency (glycogenosis type II, Pompe disease). Curr Mol Med. 2002;2:145-166.
PATOLOGIA
La progressione della Malattia di Pompe
• Dosaggio dell’attività enzimatica della GAA su:– Goccia di sangue essiccato (Dried Blood Spot) (tecnologia
emergente)– Leucociti– Fibroblasti cutanei– Biopsia muscolare
• Dosaggio del gluco-tetrasaccaride derivante dal glicogenonelle urine
• Analisi delle mutazioni genetiche
• Diagnosi prenatale tramite– Amniocentesi– Prelievo dei villi coriali
Hirschhorn R, Reuser AJJ. Glycogen storage disease type II: acid alpha-glucosidase (acid maltase) deficiency. The Metabolic and Molecular Bases ofInherited Disease. 8th ed. New York: McGraw-Hill; 2001:3389-3420.Umapathysivam K, Hopwood JJ, Meikle PJ. Determination of acid alfa-glucosidase activity in blood spots as a diagnostic test for Pompe disease. ClinChem. 2001;47:1378-1383.Yijun L, Scott R, Chamoles N, Ghavami A, Pinto B, Turecek F, Gelb M. Direct multiplex assay of lysosomal enzymes in dried blood spots for newbornscreening. Clin Chem. 2004;50:1785-1796.Chamoles NA, Niizawa G, Blanco M, Gaggioli D, Casentiini C. Glycogen storage disease type II: enzymatic screening in dried blood spots on filterpaper. Clin Chimica Acta. 347, 2004:97-102
Dosaggio dell’attività enzimaticadell’α glucosidasi acida
DIAGNOSI
Malattia di Pompe identificata dal test di macchia di sangue essiccato per dosaggio enzimatico dell’α glucosidasi acida
Inviati a: Dott. Severo PAGLIARDINI Ospedale Sant’Anna Torino
DBS (Dried Blood Spot)
Il metodo usato per la determinazione dell’αglucosidasi acida (GAA) su spot è
di tipo fluorimetrico e viene eseguito a pH acido (pH 4) e poi rapportato al pH 6.5
(pH6.5/pH4).Se il valore è basso bisogna confermare il
sospetto di patologia di Pompe ripetendo il dosaggio GAA su sangue intero e poi
confermando con il dosaggio sui leucociti.
Vantaggi DBS
1. Metodo non invasivo;2. Piccola quantità di sangue usata (200µl)
contro i 3-5 ml dei linfociti;3. L’attività dell’enzima nello stato di
essiccamento rimane stabile a temperatura ambiente quindi lo spot può essere conservato e spedito al laboratorio che esegue il test senza problemi;
4. Tempi di risposta molto brevi.
Dosaggio dell’attività enzimatica GAA sui leucociti
• Occorrono 3-5 ml di sangue;• Il dosaggio viene eseguito su pappa
leucocitaria;• La presenza di isoenzimi che interferiscono
con l’attività della GAA è stata superata usando degli inibitori per cui questo metodo serve a confermare la diminuzione dell’attività trovata con il DBS;
• Tempi di risposta più lunghi (6-8 settimane).
Dott.ssa Amelia MorroneResponsabile Laboratorio
di Biologia Molecolare
Dosaggio dell’attività enzimatica GAA su fibroblasti cutanei
• È un metodo più invasivo;• I tempi di risposta sono di 1-2 mesi in
quanto è necessario attendere la confluenza cellulare.
Dosaggio dell’attività enzimatica GAA su biopsia muscolare
È un metodo invasivo ma con tempi di risposta più rapidi rispetto a quello
eseguito sui fibroblasti
Dosaggio del gluco-tetrasaccaride
derivante dal glicogeno• I pazienti affetti da Malattia di Pompe presentano un
aumento dell’escrezione di questo metabolita nelle urine.
• Questo marker è utile per monitorare l’efficacia della terapia ma non la diagnosi, anche se la coesistenza di aumentata escrezione di gluco-tetrasaccaride nelle urine e diminuizione dell’ attività del GAA portano a una conferma della diagnosi.
MALATTIA DI POMPEATTIVITA’ ENZIMATICA RESIDUA
• L’attività residua di GAA è generalmente inversamente correlata alla severità della malattiaInsorgenza infantile Insorgenza tardiva<1% del normale <40% del normale
Hirschhorn R, Reuser AJJ. Glycogen storage disease type II: acid alpha-glucosidase (acid maltase) deficiency. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. 8th ed. New York: McGraw-Hill; 2001:3389-3420.
PATOLOGIA
INSORGENZA INFANTILE* INSORGENZA TARDIVA
100%
0%
STAT
O C
LINI
CO ATTIVITÀ R
ESIDU
A GAA
(FIBR
OB
LASTI CUTANEI)
501ETÀ (ANNI)
*CARDIOMIOPATIA
0%
100%
40%
Hirschhorn R, Reuser AJJ. Glycogen storage disease type II: acid alpha-glucosidase (acid maltase) deficiency. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. 8th ed. New York: McGraw-Hill; 2001:3389-3420.
MALATTIA DI POMPEMODELLO DI EREDITARIETÀ
EREDITARIETÀ
Eredità autosomica recessivaPadre portatore Madre portatrice
Soggetto affetto(25%)
Sani ma portatori (50%) Sani(25%)
Allele anormale
Allele normale
• Il gene per la GAA è localizzato sul cromosoma 17;
• Il gene contiene 20 esoni di cui il primo non è codificante• Sono circa 200 le mutazioni del gene GAA a tutt’oggi identificate;
– I difetti includono cambi di coppie di base con mutazioni di senso e non senso, difetti di splicing e delezioni e inserzioni di piccole e grandi dimensioni.
– Alcune mutazioni sono comuni nella popolazione generale o in gruppi etnici specifici; la maggior parte consiste tuttavia in mutazioni identificate in singoli soggetti.
• Elenco aggiornato delle mutazioni:www2.eur.nl/fgg/ch1/pompe/mutations.html
MALATTIA DI POMPE: GENETICA
EREDITARIETÀ
Raben N, Plotz P, Byrne BJ. Acid alfa-glucosidase deficiency (glycogenosis type II, Pompe disease). Curr Mol Med. 2002;2:145-166.Mutations in GSD II. Available at: http://www2.eur.nl/fgg/ch1/pompe/mutations.html.
Analisi molecolareDopo conferma della diagnosi mediante test
biochimico, l’identificazione della mutazione nel gene GAA non è strettamente necessaria.
Tuttavia, il test molecolare è di notevole importanza perché permette di identificare in
modo inconfutabile il portatore di una mutazione ed è quindi fortemente consigliato
a tutti i parenti prossimi di un paziente, soprattutto nel caso questi avessero
l’intenzione di avere un figlio.Finora sono state identificate più di 200
mutazioni diverse
Biopsia muscolare
La biopsia muscolare viene eseguita: • quando non abbiamo dati clinici
fortemente indicativi per malattia di Pompe;
• quando abbiamo dati clinici fortemente indicativi per malattia di Pompe ma il dosaggio dell’ attività enzimatica è normale;
Forma infantileEmatossilina Eosina e Tricromica di Engel: presenza di vacuoli
PAS: i vacuoli appaiono PAS positivi contenenti glicogeno
Fosfatasi Acida: i vacuoli sono positivi alla fosfatasi acida lisosomiale
Forma adulta
Ematossilina Eosina: presenza di vacuoli
PAS: i vacuoli appaiono PAS positivi contenenti glicogeno
Fosfatasi Acida: i vacuoli sono positivi alla fosfatasi acida lisosomiale
Diagnostica differenzialeVacuoli presenti nella glicogenosi di tipo II sono simili a quelli osservati nei pazienti con Malattia
di Danon. Questa malattia è legata alla mutazione del gene
LAMP2 che codifica per la proteina 2 associata alla membrana lisosomiale implicata nella
maturazione dell’autofagosoma e fusione al lisosoma.
Le manifestazioni cliniche ed ereditarie però sono diverse.
Diagnostica differenziale
Glicogenosi dovuta a deficit dell’enzima deramificante caratterizzata da vacuoli
PAS positivi ma da un piccolo incremento della fosfatasi acida e alla microscopia elettronica il glicogeno non è mai legato
alla membrana e non vi è materiale autofagico.
MALATTIA DI POMPE A INSORGENZA TARDIVA. Algoritmo diagnostico
American Association of Neuromuscular & Electrodiagnostic Medicine
Muscle & Nerve, 2009
Ipostenia muscoli cingolo pelvico
Valutazione neurologica CK, LDH, AST, ALT
Difficoltàrespiratorie
FCV da posizioneseduta e supina
IposteniadiaframmaENMG
Elementi suggestivi di una malattia di Pompe
o di una miopatia non specifica
Attività enzimatica GAA su sangue
Biopsia muscolareMiopatia vacuolare +
accumulo di glicogeno lisosomiale
SI
Attività enzimatica GAA su muscolo o sangue
Attività enzimatica ridotta
Attività enzimatica normale
Considerare una diagnosi diversa
Attività enzimaticanormale
Attività enzimatica ridotta
Confermare la ridotta attività enzimatica GAA su un secondo campione
e/o analisi genetica
Positivo NegativoMalattia di Pompe confermata
Elementi suggestivi di una
patologia specifica
Pattern miopatico
Considerare una diagnosi diversa
NO