SVILUPPO E VALIDAZIONE SPERIMENTALE DI TERAPIE SVILUPPO E VALIDAZIONE SPERIMENTALE DI TERAPIE PER IL TRATTAMENTO DELLA GLICOGENOSI TIPO 1PER IL TRATTAMENTO DELLA GLICOGENOSI TIPO 1
Luigi VaresioAIG Rimini 2012
TERAPIA GENICA
TERAPIA CELLULARE
TERAPIA GENICA vettori virali che esprimono il gene sano
Vettori adeno associati Reazione immunitariaReazione immunitaria
SpecificitàSpecificità di tessuto
Totale (KO)
(JY Chou)
• Vettori virali• Vettori cellulari
Condizionale
(A. Eva)
Fegato
• Danno epatico• Adenomi
Condizionale_Inducibile
(F. Rajas)
• Danno epatico• Danno renale• Danno intestinale
Naturale (KO)
(D.A. Weinstein
• Validità dei trattamenti
Modelli animali GSD1
Conoscere la malattiaConoscere la malattia
Sperimentare i trattamentiSperimentare i trattamenti
Modello condizionale fegato
Abbiamo prodotto dei topi che mancano dell’enzima G6Pasi solo nel fegato
X
Topo Cre-fegatoTopo condizionale
Topo KO solo fegato
2) L’ insorgenza di adenomi / carcinomi
1) Il danno al fegato della malattia
Questi animali servono per studiare:
I topi condizionali fegato
sono vitali
Sono ipoglicemici solo dopo digiuno
Hanno fegato
alterato
Istologia
normale KO condizionale
Glicogeno
normale KO condizionale
Grassi
normale KO condizionale
Glicemia
normale KO condizionale
---- digiuno
Glu
co
sio
(m
g/d
l)
---- digiuno
Terapia genica in topi KOTerapia genica in topi KO
Trattamento Fegato Rene Sopravvivenza
Adenovirus + +/- 1 mese
Adenovirus + +/- <12 mesi+ adeno associato 1
Adeno associato 1 + +/- <11 mesi
Adeno associato 8 + ? < 18 mesi
Conclusioni La terapia genica con vettori virali funziona per il
fegato ma non per il rene.
Zingone A et al., J Biol Chem 275:828–832, 2000Sun M-S et al., Hum Mol Gen: 11: 2155–2164, 2002Ghosh A, Gene Ther 13:321–329, 2006Yiu WH, Mol Ther. 18:1076-1084, 2010Grinshpun A et al., Mol Ther 18:1592–1598 2010
Modello murinoTerapia genica in cani KOTerapia genica in cani KO
Trattamento Fegato Rene Sopravvivenza
Adeno associato 1 e 8 + ? ~11 mesi
CONCLUSIONI
La terapia genica con vettori virali funziona anche per i cani
Koeberl DD, Mol. Ther. 16: 665–672, 2008Beaty1 RM, Gene Ther 9:1015–1022, 2002D. A. Weinstein et al. Hum Gene Ther 21:903–910, 2010.
Terapia cellulare per la GSD 1a
KOcontrol
Cellule: staminali ematopoieticheCellule: staminali ematopoietiche
Fonte: midollo osseo normaleFonte: midollo osseo normale
Via di inoculo: vena temporaleVia di inoculo: vena temporale
˜ ˜ ˜ ˜ ˜ ˜
Cellule staminali ematopoietiche
Età del topo malato: 2 giorniEtà del topo malato: 2 giorni
normali KO non trattati KO trattatiKO trattati
Analisi dei fegati dei topi KO a tre settimane dal trapianto di staminali
Rosa26 Rosa26 GFP GFP
a b c
20 m 20 m
Treated G6pc-/-
anti -galactosidase
Treated G6pc-/- Untreated G6pc-/-
-galactosidase activity
Rosa26
Liver repopulation by Rosa 26- and GFP-Tg-derived BMMs
2500 m
Treated G6pc-/-
HNF1
GFP
Albumin
Rosa26 GFP
d e
100 m
Treated G6pc-/-
100 m
Untreated G6pc-/-
Ripopolazione del fegato con mielomonociti di topi normaliAttività -galattosidasi
KO trattati
Anti -galattosidasi
KO non trattati KO trattati
KO trattati KO trattatiKO non trattati
Aspetto istologico dei fegati trattati Presenza di fusione cellulare
Ripopolazione del fegato Espressione e attività G6PasiCaratteristiche delle cellule fuse
Parametri funzionali e di sopravvivenza
Sopravvivenza Sopravvivenza
GiorniGiorni
% s
op
ravv
iven
za%
so
pra
vviv
enza
Non trattatiNon trattatiTrattatiTrattati
Parametri Parametri funzionalifunzionali
KO non trattatiKO non trattati(% del normale)(% del normale)
KO trattatiKO trattati(% del normale)(% del normale)
EpaticiEpatici
G6PasiG6PasiGlucosioGlucosioColesteroloColesteroloTrigliceridiTrigliceridiALTALTASTAST
11 1111 253253 629629 35035010551055
99 6060131131266266192192562562
RenaliRenali
AlbuminaAlbuminaCreatininaCreatinina
10301030 529529
12201220 448448
Il rene nei topi trattati con cellule staminali
Normali KO trattatiKO non trattati
Il trattamento dei topi KO neonati con staminali:
• determina un miglioramento dei valori metabolici epatici
• determina un miglioramento della sopravvivenza dei topi KO
• non ha effetto sul rene
Resaz R. et al. J. Hepatol. 2011
Sviluppo di strategie terapeutiche combinate
cellulari e virali per raggiungere il rene e
aumentare l’efficacia
Terapia combinata virale e cellulare
1) Terapia del fegato con cellule staminali ingegnerizzate con vettore virale• Aumentare l’efficienza e mimare la situazione del paziente
2) Terapia del rene con virus adeno-associato con tropismo renale• Curare il rene
Purificazione etitolazione del virus
Inoculo nel rene
Prelievo di cellulestaminali da femore di topo normale
Infezione delle cellulestaminali con il virus
Inoculo nellavena temporale delle cellule ingegnerizzateper il trattamento epatico
• Utilizzo di un vettore adeno-associato che esprime la G6Pasi umana sotto il controllo del promotore/enhancer del gene G6PC umano. (Yiu W H et al., Mol. Ther., 2010).
2) Terapia del rene con vettore virale adeno-associato con tropismo renale
Incisione della cute
Visualizzazione del rene
Inoculo del vettore virale nel rene
Procedura chirurgica
Un mese dopo
KO
WT
Terapia del rene con virus adeno-associato con tropismo renale
PRIMI ESPERIMENTI
Visualizzazione di cellule fluorescenti a due settimane dall’inoculo
20X 100X
Utilizzo di un vettore fluorescente per la visualizzazione in vivo delle cellule renali infettate
Dati preliminari
Topo Trattamento Glicemia Glicemia aTopo Trattamento Glicemia Glicemia a Peso fegato/ Peso fegato/ Peso rene nonPeso rene non mg/dl digiuno (12 ore) peso corporeo mg/dl digiuno (12 ore) peso corporeo trattato/pesotrattato/peso
mg/dlmg/dl % % corporeo (%)corporeo (%)
Normale Normale -------- 130 65-------- 130 65 4 4 1.21.2
KO -------- <40 <20KO -------- <40 <20 12 12 2.2 - 42.2 - 4
KO KO AAV + staminali 100 AAV + staminali 100 152 152 9 9 1.21.2
KO KO AAV 101 AAV 101 44 44 14 14 1.41.4
Topi inoculati nel rene con virus adeno-associato (AAV)
E’ possibile correggere il difetto de rene e del fegato causato dalla GSD1a utilizzando terapia genica con vettori cellulari e virali in combinazione
Glicogenosi 1b
Causa:
mutazione del trasportatore del glucosio-6-fosfato dal citoplasma al reticolo endoplasmatico.
Conseguenze:
• ipoglicemia, epatomegalia, nefromegalia, iperlipidemia, iperuricemia, acidosi lattica, ritardo della crescita, problemi epatici e renali a lungo termine (come per la GSD1a).
• neutropenia e disfunzione dei neutrofili .
• infezioni batteriche ricorrenti, malattia infiammatoria intestinale, o enterocolite.
G
Trasp
Reticolo endoplasmatico
G6P
Trasp
GG6Pasi
GSD1a
GSD1b
?
G6Pasi
Neutrofili
G6P
Neutropenia congenita severa
G6P
Trasp
G6Pasi
GSD1a
G6Pasi
FegatoReneIntestino
GSD1b
G6Pasi
G6Pasi
FegatoReneIntestino
Neutrofili
Neutropenia congenita severa
G6Pasi
Neutrofili
G
Nel midollo osseo si producono le cellule del sangueNel midollo osseo si producono le cellule del sangue
TERAPIA GENICA PER LA GLICOGENOSI 1b
Modello animale (J.Y. Chou) poco utilizzabile: morte precoce per infezione.Modello animale (J.Y. Chou) poco utilizzabile: morte precoce per infezione.
Problemi della terapia genica
Effetto transitorio Effetto transitorio sulla funzionalità e il numero di neutrofili.sulla funzionalità e il numero di neutrofili.Breve vita dei neutrofili il cui rinnovo dipende dalle cellule staminali multipotenti del midollo.Breve vita dei neutrofili il cui rinnovo dipende dalle cellule staminali multipotenti del midollo.
Generare un modello animale condizionale inducibileGenerare un modello animale condizionale inducibile(Progetto collaborativo con la Dr. Chou possibile)(Progetto collaborativo con la Dr. Chou possibile)
Trapianto di midollo osseo per il trattamento della neutropenia e della Trapianto di midollo osseo per il trattamento della neutropenia e della disfunzione dei neutrofilidisfunzione dei neutrofili
Trapianto di midollo osseo
Trattamento con vettori cellulari o virali
Iniezione delle cellule di midollo normali
Combatte le infezioni ricorrenti e l’infiammazione intestinale
Rigenerazione funzionalità epatica e renale
PRIMA DEL TRAPIANTO DOPO IL TRAPIANTO
Neutrofili 0.3-0.9 x 109/L (con G-CSF) 0.4-4.1 x 109/L (senza CG-CSF)
Piastrine 4-145 x 109/L 89-262 x 109/L
Movimenti intestinali 12-20 volte al giorno 1-2 volte al giorno
Trigliceridi 1.27-5.37 mmol/L 1.85-5.35 mmol/L
Colesterolo 1.9-2.7 mmol/L 2.3-4.4 mmol/L
Lattato 1.1-3.5 mmol/L .8-2.2 mmol/L
Urati 248-478 mmol/L 176-298 mmol/L
Ricoveri ospedalieri 13 in 12 mesi 2 in 14 mesi
Regime di nutrizione Naso-gastrico continuo (24 ore) Amido di mais ogni 4 ore
Trapianto di midollo nella Glicogenosi 1b
Bone Marrow Transplantation in Glycogen Storage Disease Type 1b
GERMAINE PIERRE, MBBS, MRCPCH, GEOTHY CHAKUPURAKAL, MRCP, PATRICK MCKIERNAN, BSC, MBBCH, FRCPCH,CHRIS HENDRIKSZ, MBCHB, MRCPCH, SARAH LAWSON, BSC, MBCHB, MRCP, FRCPATH, AND ANUPAM CHAKRAPANI, MD, FRCPCH
We report a case of glycogen storage disease type 1b that was successfully treated with bone marrow transplantation after life-threatening complications related to neutropenia and thrombocytopenia. Concomitant reduction in inflammatory bowel disease–related symptoms and improved metabolic stability were also observed. (J Pediatr 2008;152:286-8)
Clinical Trial negli USA
• Collaborazione NIH, Florida e Canada per trattare 10 pazienti adulti affetti da glicogenosi 1a con vettori virali • Il Trial è stato approvato da Food and Drug Administration
Istituto G. Gaslini, GenovaIstituto G. Gaslini, GenovaLaboratorio di Biologia MolecolareLaboratorio di Biologia Molecolare
• R. ResazR. Resaz• D. Segalerba D. Segalerba • C. VanniC. Vanni• A. EvaA. Eva• L. VaresioL. Varesio
Istituto G. Gaslini, GenovaIstituto G. Gaslini, GenovaLaboratorio di Biologia MolecolareLaboratorio di Biologia Molecolare
• R. ResazR. Resaz• D. Segalerba D. Segalerba • C. VanniC. Vanni• A. EvaA. Eva• L. VaresioL. Varesio
NationalNational Institutes of Health, Institutes of Health, (USA)(USA)• J. ChouJ. ChouNationalNational Institutes of Health, Institutes of Health, (USA)(USA)• J. ChouJ. Chou
IST, Genova, IST, Genova, • O. BarbieriO. Barbieri
IST, Genova, IST, Genova, • O. BarbieriO. Barbieri
Università di TorinoUniversità di Torino• G. TaroneG. Tarone
Università di TorinoUniversità di Torino• G. TaroneG. Tarone
Istituto G. Gaslini, GenovaIstituto G. Gaslini, Genova• A. SementaA. Sementa• M. DiRoccoM. DiRocco
Istituto G. Gaslini, GenovaIstituto G. Gaslini, Genova• A. SementaA. Sementa• M. DiRoccoM. DiRocco
La Dott.ssa Janice Y. Chou ci fornirà : La Dott.ssa Janice Y. Chou ci fornirà :
•i cloni del gene i cloni del gene G6PTG6PT per generare il modello animale condizionale per generare il modello animale condizionale inducibile inducibile
•Il vettore AAV-G6PT per produrre il virus per il trattamento del Il vettore AAV-G6PT per produrre il virus per il trattamento del fegato e del rene del topo inducibilefegato e del rene del topo inducibile
Topi trattati con virus adeno-associato con tropismo renale
Dati preliminari
Modelli animali GSD1
Topi Knock out (KO) Cane GSD
Totale (KO) (JY Chou) Condizionale (A. Eva)
Fegato
Condizionale_Inducibile (F. Rajas)• Fegato • Rene • Intestino
Totale (KO) (D.A. Weinstein)
Efficacia terapeutica cellule staminali ematopoietiche
Valutazione di:
•Aspetto istologico dei fegati trattati
•Presenza di fusione cellulare
•Espressione e attività dell’enzima G6Pasi
•Parametri funzionali epatici e renali
•Sopravvivenza dei topi
•Quantificazione di attecchimento nel fegato delle cellule staminali