Donatella NavaIstituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno
DefinizioneLa citrometria a flusso è un metodo di conteggio, ed
eventualmente di selezione e isolamento, di elementi corpuscolati (cellule) che, dopo essere state marcate con un colorante,vengono fatti passare singolarmente attraverso un sistema ottico di rilevazione a flusso laminare e quindi conteggiate.
Per utilizzare la citometria nella ricerca di target non corpuscolati, quali gli allergeni, è necessario farli adsorbire a strutture cromaticamente inerti, aventi dimensioni assimilabili a quelle di una cellula (microsfere in lattice).
Principio di funzionamentodella citometria a flusso
1) Le cellule di una popolazione eterogeneavengono aspirate dalla provetta e immessein una camera di flusso dove vengonoseparate le une dalla altre.
2) Ogni singola cellula viene poi attraversatada un fascio di luce che eccita i fluorocromi edetermina l’emissione di un segnaleFluorescente
3) Il segnale passando attraverso un sistema di filtri e specchi raggiunge un rivelatore.
4) Viene quindi processato elettronicamente,trasformato da analogico a digitale e inviatoall’analizzatore, che elabora il dato e lovisualizza tramite un grafico.
5) Attraverso piastre di deflessione le celluleanalizzate possono essere raccolteseparatamente tramite un processo definito“sorting”.
In seguito alla riorganizzazione dell’Istituto, non è stato possibile esaminare i campioni nei nostri
laboratori. L’analisi è stata effettuata dal laboratorio di immunologia della facoltà di Agraria
di Portici.
E’ stato utilizzato un FACScan flow cytometer (Becton Dickinson USA)
L’analisi è stata eseguita seguendo il protocollo messo a punto nel laboratorio per la
ricerca della gliadina
Diagramma di flusso
Estrazione in etanolo
Diluizione estratto
Adsorbimento sulle microsfere
Aggiunta anticorpi anti target
Incubazione con anticorpi anti IgG di ratto marcati
Lettura al citofluorimetro
L’approccio diagnostico è basato sull’utilizzo di particelle in latex di 3 µm (Polysciences, Warrington, PA, USA) trattate con 1 ml di estratto in etanolo (60%) del campione in esame.
Quindi lavate 2 volte in PBS e trattate con soluzione di arresto (Kirkegaard & Perry Laboratory).
Le microsfere venivano incubate in successione con anticorpi di ratto (1:50 PBS) verso i target ricercati (anti b-
lattoglobulina o anti ovoalbumina) (Sigma-Aldrich) specifici verso l’antigene, quindi con anticorpi anti IgG di ratto
marcati con isotiocianato (RαG - FITC) (Sigma-Aldrich) diluito 1:600 in PBS
L’indagine è stata eseguita esclusivamente sui campioni di biscotti e polpette di carne inviati al
laboratorio per l’esecuzione dei test immunoenzimatici.
Alcuni campioni non sono stati sottoposti all’analisi citofluorimetrica in quanto utilizzati interamente
per i saggi ELISA.
La titolazione è stata effettuata diluendo β-lattoglobulina e ovoalbumina (Sigma-Aldrich) in PBS
Come controllo negativo si è utilizzato un campione nel quale gli anticorpi marcati erano sostituiti con
PBS
Le indagini sono state eseguite separatamente per la ricerca di lattoglobulina e ovolabumina.
OVOALBUMINE - BISCOTTI
ELISA Test Cf analysis
ppm First replicate (ppm)
Sec. replicate (ppm) Third replicate (ppm)
mean SD
0 0 0 0 0 0
5 NE NE NE NE NE
15 18,28456 13,65489 21,98547 17,97497333 4,173909883
30 35,25647 31,25658 39,32654 35,27986333 4,035030859
60 65,21455 68,29865 61,25455 64,92258333 3,531114499
OVOALBUMINE - BISCOTTI
Biscuits
020406080
L0 L1 L2 L3 L4
Samples
ELISA test
Citofluorimetricanalysis
POLPETTE - LATTE
ELISA Test Cf analysis
ppm First replicate
(ppm)Second replicate
(ppm)Third replicate
(ppm) mean SD
0 0 0 0 0 0
1 NE NE NE NE NE
3 8,26599 5,32221 9,36598 7,651393333 4,173909883
6 10,25648 13,23254 8,23658 10,5752 4,035030859
12 14,14897 12,65984 15,25885 14,02255333 3,531114499
POLPETTE - LATTE
Meat
05
101520
L0 L1 L2 L3 L4
Samples
ELISA test
Citofluorimetricanalysis
La citometria a flusso sembra più sensibile dell’ELISA, anche se il divario rilevato con il test immunoenzimatico in relazione alla ricerca delle ovoalbumine, pone il dubbio
di una possibile tendenza alla sovrastima dell’analisi citofluorimetrica.
Ha però il limite di prevedere protocolli più sofisticati e dispendiosi che non ne giustificano l’impiego nella
routine diagnostica.
In questo lavoro sono stati posti i preliminari per una futura applicazione della citofluorimetria nella ricerca
degli allergeni in diagnostica
CONCLUSIONI
I campioni sono stati omogeneizzati (2 min in un omogeneizzatore a lame ) e quindi trattati con etanolo.
Come controllo positivo sono stati allestiti campioni (1 mg) di carne e sfarinati, uova-latte free, contaminati con l’aggiunta di latte e uova (da 1 a 10-3 ppm), sono stati utilizzati e trattati per l’estrazione come sopra descritto.
Particelle in latex (105) con un diametro di 3 micron (Polysciences) sono state incubate overnight con 1 ml di proteine standard di uovo o latte (Sigma-Aldrich), quindi cimentate con 1 ml di estratto ottenuto come sopra descritto.