La sierologia si può usare come screening?
Non sul singolo animale:
Solo 11,8% (12/102) con PCR ed ELISA pos.
Solo 3,92% (4/102) con PCR e FDC pos.
FDC viene confermata da ELISA
FDC è frequentemente associata allo stato di
animale eliminatore
ELISA va bene come screening di gruppo
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
ELISA valido screening ( anche latte) prova
indiretta, Ag in fase I+II
FDC specifica ma poco sensibile - soglia
1:10, Ag in fase II
PCR: eliminazione intermittente,
diagnosi costosa
Attribuzione di indennità non del tutto certa
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
Non esiste un metodo ufficiale, anche se tutti sono citati dal Manuale OIE
IFAT ed ELISA sono confrontabili
FDC poco sensibile perché: Fattori anticomplementari nel siero
Sub-classi IgG: nei ruminanti solo IgG1 fissano il complemento
IgG2 e IgM possono inibire la FDC da parte di IgG1
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
IFAT: no kit ad uso veterinario, poco standardizzabile
ELISA: diversi kit e diverse sensibilità
Raccomandato l’uso di kit ELISA con Ag isolati da ruminanti
Da definire i cut-off
Sierologia da sola non è sufficiente
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
Fondamentale perché: I segni clinici non sono specifici C’è un’alta frequenza di infezioni inapparenti I gruppi con alta prevalenza di infezione sono
anche quelli importanti per la salute pubblica Diagnosi differenziali: agenti abortigeni
(Brucella, Chlamydophila, Toxoplasma, Salmonella, ecc.)
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
Immunità umorale – Ab rilevabili 2-3 sett. PI; prima anti-fase II
Eliminatori sieronegativi
Immunità cellulo-mediata: cruciale per la protezione – skin test, IFN- test
Modulazione tra IFN-e IL-10 (dipendente da ospite, ceppo, DI)
Risposta a vax anti fase II vs fase I
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
Sieroconversione sul singolo è solo indicativa di circolazione dell’agente
Sierologia ok se combinata alla PCR
Sieri da gruppo di soggetti con problemi rirpoduttivi/aborto: almeno 6 animali, 3 primipare e 3 pluripare, che hanno abortito (tra 15 gg e 4 mesi), o con problemi riproduttivi
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
Animali possono restare sieropositivi per anni dopo infezione acuta
Alcuni eliminano Coxiella prima di sieroconvertire
Alcuni non sieroconvertono
Non distinguibile vaccinazione
Skin test per selezionare animali negativi da vaccinare
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
PCR: ad oggi il metodo più rapido e sensibile per identificare gli eliminatori
Real-time PCR: quantificazione
Specificità comparabile tra diversi laboratori
Sensibilità: multiple copy target IS1111 più sensibile
Matrici: tampone vaginale, placenta, (alta carica), latte (bassa carica), feci, urine, sperma (sporadici)
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
L’eliminazione può persistere per mesi, ma la massima escrezione avviene entro una settimana da parto o aborto
Campione: tampone vaginale, placenta, cotiledoni (aree necrotiche), organi fetali (milza, polmone, fegato) o contenuto abomasale del feto
Conferimento al laboratorio per estrazione DNA entro 48-72 ore, campione a +4°C
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
Tampone vaginale/placenta: matrici ideali Feci, latte: eliminazione debole e/o discontinua Latte di massa: eliminazione frequente in
vacche asintomatiche, meno in pecore Capre: osservate tutte e tre le vie, ma il latte
sembra una via frequente LATTE DI MASSA: buono screening per bovini
e capre (ma non per diagnosi di aborto)
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
PCR su placenta o tampone vaginale: 104 batteri/g
In tessuti fetali o contenuto abomasale del feto: è sufficiente un risultato positivo
Per campioni in pool (tamponi): 103 batteri/g per pool
Alla lettura dell’esito: soglia di positivit{ Real-time PCR è Ct<40
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
Soggetti N. campioni Analisi Numero
Feti/vacche
Aborto<8gg
Tampone vag.
placenta
organi fetali
Real-time PCR Fino a 3 vacche
Aborti tra i 15 gg
e 4 mesi prec.
Siero ELISA
Almeno 6 (3
primipare e 3
pluripare)
Vacche con
problemi
riproduttivi
Solo se il primo
gruppo è <6
(Vacche di
controllo)
Es. 2 aborti analizzati:
a) Entrambi PCR+: diagnosi confermata
b) 1 PCR+ e sierologia con meno di 50% di positività: ritestare dopo 3 settimane
a) >50% positivi: confermata
b) <50% positivi: improbabile
c) Entrambe PCR -: diagnosi esclusa
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
Es. 1 aborto analizzato + 6 sieri:
a) PCR+ e sierologia >50%: confermata
b) PCR+ e sierologia <50%: ritestare dopo 3 settimane, come sopra
c) PCR- e sierologia >50%: testare altri aborti
d) PCR- e sierologia <50%: esclusa
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
Se PCR è negativa, la sierologia:
a) >50% positivi: sospetto – monitorare aborti con PCR
b) <50% positivi: esclusa
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
Soggetti N. campioni Analisi Numero
Feti/capi
Aborto<8gg
Tampone vag.
placenta
organi fetali
Real-time PCR
+ d.d.
2 PCR individ.
2 pool di 3 capi
Se c’è solo 1 campione per PCR o se 1 è negativa
Aborti tra i 15 gg
e 3 sett. prec.
Siero ELISA
Almeno 10 capi,
privilegiando
quelli con
problemi
Capi con
problemi
riproduttivi
(Capi di
controllo)
Es. 2 aborti analizzati
a) Entrambi PCR+: diagnosi confermata
b) 1 PCR+: testare nuovi soggetti con PCR, se almeno un altro è +: conferma
c) Entrambe PCR-: diagnosi esclusa
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
Es. 1 aborto analizzato + 10 sieri:
a) PCR+ e sierologia >50%: confermata
b) PCR+ e sierologia <50%: caso isolato? Monitorare nuovi casi
c) PCR- e sierologia >50%: monitorare nuovi casi
d) PCR- e sierologia <50%: esclusa
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
Es. disponibili solo sieri (10 o più)
Se 50% o più positivi, diagnosi confermata
Se meno di 50%, continuare monitoraggio sui nuovi casi
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
Protocollo diagnostico (Rodolakis 2006)
PCR su latte di massa
Sierologia su 10 vacche–problemaPCR +, sierologia > 50%: sì FQPCR +, sierologia < 30%: FQ recentePCR -, sierologia > 60%: sospetto moderatoPCR -, sierologia < 30%: sospetto debolePCR -, sierologia 0: no FQ
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
Aborti tardivi, natimortalità, nascita di soggetti deboli (fino al 90% delle femmine gravide può essere infetta)
PCR o isolamento positivo (tampone vaginale, placenta o feto)
Sierologia positiva (>50%)
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
Stalle < 100 capi: 2 aborti/mese o 3/anno Stalle > 100 capi: >4% di aborti/anno Metriti, infertilità, aborti, vitelli con scarso peso alla
nascita Altri sintomi: polmoniti, aborti, parti prematuri, nati
deboli, metriti, infertilità PCR o isolamento positivo (tampone vaginale,
placenta o feto) Sierologia positiva >50%
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
Aborto / parto
Una settimana dopo il parto / aborto nello scolo vaginale
Fino a 2 anni nel latte
Discontinua nelle feci
Urine?
Migliori matrici per PCR sono: placenta, latte, tampone vaginale nei primi giorni dall'aborto
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
Treviso 2007: problemi diffusi di infertilità inallevamento di bovine da latte. Esclusi BVDV,Neospora caninum, Brucella abortus, IBRV,Chlamydophila spp. e Leptospira spp.
Sieropositivi per Febbre Q 4/6 animali.Monitorate le diverse vie di eliminazione e la persistenza
dell’infezione
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
Campioni individuali di siero, tamponi vaginali, feci e latte sulle 77 vacche (42 in lattazione)
Selezionati 20 animali (10 positivi + 10 negativi) per “follow-up study”. “Positive” se positivi almeno a 2 test; “negativi” se negativi a tutti i tests.
Ogni 3 mesi: Real-time PCR su latte, feci e tamponi vaginali sui 20 soggetti, sierologia su tutte le vacche in lattazione.
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
Table 1: sampling timetable and results of the different assays used for C. burnetii
No. positives/total examined (%)
PCR Sampling
date CFT ELISA
Milk Faeces Vaginal swab 28/05/07 2/6
(33.3)
4/6
(66.6)
-- -- --
19/06/07 1/6
(16.6)
4/6
(66.6)
2/6
(33.3)
-- --
01/08/07** 4/77
(5.2)
61/77
(79.2)
6/43
(13.9)
9/77
(11.7)
1/54
(1.85) 22/08/07 3/9 8/9 6/7 -- -- 10/10/07 3/50
(6)
27/50
(54)
7/22
(31.81)
2/20
(10)
4/20
(20) 23/11/07 1/51
(2.0)
27/51
(53.9)
-- -- --
07/02/07 2/46
(4.3)
23/46
(50)
8/21
(38,1)
0/20
(0)
1/20
(5)
** first screening on the whole herd
Table 1: sampling timetable and results of the different assays used for C. burnetii
No. positives/total examined (%)
PCR Sampling
date CFT ELISA
Milk Faeces Vaginal swab 28/05/07 2/6
(33.3)
4/6
(66.6)
-- -- --
19/06/07 1/6
(16.6)
4/6
(66.6)
2/6
(33.3)
-- --
01/08/07** 4/77
(5.2)
61/77
(79.2)
6/43
(13.9)
9/77
(11.7)
1/54
(1.85) 22/08/07 3/9 8/9 6/7 -- -- 10/10/07 3/50
(6)
27/50
(54)
7/22
(31.81)
2/20
(10)
4/20
(20) 23/11/07 1/51
(2.0)
27/51
(53.9)
-- -- --
07/02/07 2/46
(4.3)
23/46
(50)
8/21
(38,1)
0/20
(0)
1/20
(5)
** first screening on the whole herd
Table 2: results of the tests conducted on 20 cows (10 positives and 10 negatives)
selected after the first screening
No. positives/total examined
PCR
CFT ELISA Milk Faeces
Vaginal
swabs
Sampling
date
positives negatives positives negatives positives negatives positives negatives positives negatives
01/08/07 4/10 0/10 10/10 0/10 4/10 0/10 1/10 0/10 0/10 0/10 22/08/07 3/8 -- 7/8 -- 6/7 -- -- -- -- -- 10/10/07 3/10 0/10 10/10 0/10 5/10 1/10 1/10 1/10 3/10 2/10 23/11/07 1/10 0/10 10/10 1/10 -- -- -- -- -- -- 07/02/08 2/10 0/10 9/10 1/10 4/10 0/10 0/10 0/10 1/10 0/10
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
Sierologia: FDC conferma bassa sensibilità ma anche alta specificità e riproducibilità nel tempo (variazione titoli da 1:64 a 1:128).
Gli animali FDC positivi sono stati ripetutamente classificati come escretori.
ELISA più sensibile, la positività si mantiene nel tempo (tranne 1 caso), e si rilevano 4 sieroconversioni. Manca una relazione con escrezione. Presenza sporadica di escretori sieronegativi.
Real-time PCR: ha permesso di identificare i nuovi escretori. Prevalenza di eliminazione con il latte, ma osservata anche in muco vaginale e feci. Nessun animale elimina nelle 3 vie in contemporanea.
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
Azienda di vacche da latte con casi di aborto e disordini riproduttivi
Capi esaminati per Coxiella burnetii mediante 2 test sierologici: ELISA indiretta e FDC.
Il latte individuale di ogni vacca in lattazione testato in Real-time PCR; sulla base dei valori Ct, gli animali sono stati classificati in forti (Ct≤31) e deboli (Ct>31) eliminatori
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
Classi di età Esito sierologico
ELISA* < 3 anni 3 - 5 anni > 5 anni Totale
Negativi 104 80 23 207
Positivi 3 32 14 49
Totale complessivo 107 112 37 256
Mandria suddivisa in 3 classi d’età (<3 anni, 3-5 anni, >5 anni), e le vacche in lattazione in 2 classi (<5 anni e ≥5 anni).
Classi di età Ct
< 5 anni ≥ 5 anni Totale
≤ 31 (forti eliminatori) 1 6 7
> 31 (deboli eliminatori) 16 3 19
Totale complessivo 17 9 26
PCR +
su latte
PCR –
su latte Totale
PCR + /
totale (%) Ct ≤ 31 Ct > 31
Gruppo 1: sierologicamente
negativi 13 82 95 13,68 0 13
Gruppo 2: sierologicamente
positivi 13 25 38 34,21 7 6
Correlazione significativa tra età e prevalenzasierologica, e tra età e status di forte eliminatore.
Risultati biomolecolari e sierologici a confronto: lacondizione di forte eliminatore è correlata ad unasierologia positiva.
L’utilizzo combinato di ELISA ed FDC è d’aiutonell’identificazione dei forti eliminatori, riducendo ilnumero di PCR necessarie allo stesso scopo e quindii costi di gestione
Sieroprevalenza Piano Aborti
ELISA: positivi 18, 5% (65/351)
FDC: 1,4% (5/353)
Totale Triveneto
ELISA: positivi 15,6% (994/6384)
FDC: 0,7% (44/6384)
Positivi a entrambi: 0,6% (39/6384)
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010
PCR Piano Aborti: positivi 2,9% (10/344)
Probabilmente sottostimata (poche placente)
Totale Triveneto:
Campioni positivi 12.3% (102/829)
Gruppi di animali con almeno una positività
31,6% (102/323)
· Sovrastimato (esami ad hoc)
Alda Natale - Soave, 30 novembre 2010