Amplificazione mediante PCR (Polymerase Chain
Reaction) del DNA estratto dalla saliva.
OBIETTIVO DEL LAVORO SPERIMENTALE: OBIETTIVO DEL LAVORO SPERIMENTALE:
TIPIZZAZIONE DEI CROMOSOMI SESSUALI X e YTIPIZZAZIONE DEI CROMOSOMI SESSUALI X e Y
Cromosoma y
Cromosoma X
La tipizzazione dei cromosomi sessuali X ed Y
tramite PCR, spesso utilizzata in medicina forense,
può essere condotta attraverso:
• 1) Amplificazione di una porzione genica
presente nel primo introne del gene codificante
per l’Amelogenina (AMEL)
• 2) Ricerca del DNA α-satellite presente a livello
dei centromeri dei cromosomi X e Y
Amplificazione di una porzione genica presente nel primo
introne del gene codificante per la proteina Amelogenina
(AMEL)
Il locus genico
proteina coinvolta nel processo di produzione dello
smalto dei denti, rappresentando in questa sede il 90%
circa di tutta la componente proteica dello smalto.
Xp22 (AMELX)
Yp11 (AMELY)
Amelogenina
alcune differenze nella
sequenza
Delezione di 6 bp in corrispondenza di una regione del primo introne
del gene AMELX rispetto al gene AMELY
►gli individui di sesso femminile essendo omozigoti per la delezione sul primo
introne del gene AMELX, presenteranno un solo prodotto di amplificazione di
106 bp
►gli individui di sesso maschile essendo eterozigoti per la delezione sul primo
introne, presenteranno due prodotti di amplificazione, uno di 106 bp relativo
al gene AMELX, e uno di 112 bp, relativo al gene AMELY.
introne introneesone esone esone
PCR
Amplificazione di una porzione genica presente nel
primo introne del gene AMEL
106 bp
112 bp106 bp
X XYDNA estratto
da filtro di
sigaretta
M
λϕϕϕϕX174X174X174X174
I prodotti di amplificazione
essendo molto vicini come
numero di paia di basi, vengono
preferenzialmente separati
mediante metodi automatizzati
(es. elettroforesi capillare),
piuttosto che con convenzionali
metodi elettroforetici su gel di
poliacrilamide o agarosio.
La tipizzazione dei cromosomi sessuali X ed Y
tramite PCR, spesso utilizzata in medicina forense,
può essere condotta attraverso:
• 1) Amplificazione di una porzione genica
presente nel primo introne del gene codificante
per l’Amelogenina (AMEL)
• 2) Ricerca del DNA α-satellite presente a livello
dei centromeri dei cromosomi X e Y
UTILIZZEREMO QUESTO SECONDO UTILIZZEREMO QUESTO SECONDO
METODO DI INDAGINEMETODO DI INDAGINE
Il DNA α-SATELLITE o alfoide è
una sequenza monomerica con una
tipica composizione di basi (A+T)
ripetuta in tandem a formare dei
blocchi che rappresentano fino a 3-
5% del DNA totale di ciascun
cromosoma.
- 250 kb nel cromosoma Y
- 5000 kb nel cromosoma 11
- 10000 kb nel cromosoma X
Ricerca del DNA α-satellite presente a livello dei
centromeri dei cromosomi X e Y
OBIETTIVO DEL NOSTRO LAVORO
Ottenere, (utilizzando la tecnica
della PCR in presenza di coppie
di primers specifici in grado di
intercettare le sequenze alfoidi
dei cromosomi X ed Y), prodotti
di amplificazione relativi a
ciascun cromosoma sessuale,
rilevabili mediante elettroforesi
su gel di poliacrilamide.
Simultanea amplificazione del DNA alfoide centromerico
presente nel cromosoma X e regione in quello Y.
PCR(Polymerase Chain Reaction)
La simultanea amplificazione del DNA alfoide centromerico, sarà condotta
utilizzando due coppie di primers in grado di delimitare una regione di ~150 bp
presente nel cromosoma X e una regione di 200 bp in quello Y.
X3 5' – TATTTGGACTCTCTCTGAGGAX4 5' - TTCTACTACAAGGGTGTTGCA
Y3 5' - GTGTATRCACCTCCGGGAGY4 5' - ACAAAAGGTTCAATTCTGTGAG
Cromosoma X
Cromosoma Y
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Amplificazione del DNA alfoide (Kit sigma JumpStart
Taq DNA Polymerase)
MISCELA DI REAZIONE
volume finale di 25 µl:
- 12 µl di DNA (1 ng)
- 2,5 µl Buffer 10x (10mM Tris-HCl pH 8,5)
- 0,7 µl Formamide
- 1,5 µl MgCl2 25 mM
- 0,5 µl dNTP mix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
- X3 for 0,5 µl
- X4 rev0,5 µl
- Y3 for 0,5 µl
- Y4 rev 0,5 µl
- 0,35 µl di Taq Polimerasi (1U )
primers
- 5,45 µl di H2O sterile
// 10’ → 72°C
45 cicli
6’ → 95°C // 1’→ 95°C - 1’ → 50°C - 1’30’’ → 72°C
FILE DI AMPLIFICAZIONE
ELETTROFORESI SU GEL DI
POLIACRILAMIDE
I prodotti di amplificazione saranno separati tramite
elettroforesi su gel di poliacrilamide e visualizzati mediante
colorazione con nitrato d’argento.
200 bp
150 bp
RISULTATIRISULTATI Amplificazione del DNA Amplificazione del DNA alfoidealfoide
prodotto di amplificazione di 150 bp relativo al cromosoma X
RISULTATI ATTESI
prodotto di amplificazione 200 bp relativo al cromosoma Y
ESERCITAZIONE DEL 22 MAGGIO 2008
Elettroforesi su gel di poliacrilammide (1 gel per ogni
gruppo)
Colorazione del gel con il nitrato d’argento
4 GRUPPI DI LAVORO
PREPARARE LE SOLUZIONI (ciascun gruppo preparerà le proprie soluzioni)
SOLUZIONI PER IL GEL DI POLIACRILAMIDE
Sol Acrilamide Bis - acrilamide 40%
Ammonio Persolfato 10% (APS)
TEMED = si usa concentrato
PREPARAZIONE DEL GEL
H2O = 17 ml
TBE 10 x = 4 ml
Sol. Acrilamide / bis-acrilamide =9 ml
APS = 300 µl
TEMED = 30 µl
PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
10 µl prodotto di PCR
2 µl loading buffer
MARCATORE DEI FRAMMENTI DI GRANDEZZA DEL DNA (uno per ogni gel)3 µl prodotto di marcatore
2 µl loading buffer
PREPARAZIONE DEI VETRI
Pulire accuratamente i vetri con etanolo 70%
Assemblare i vetri
CONDIZIONI ELETTROFORETICHE = 200 Volt costanti
TAMPONE DI CORSA = Buffer TBE 1x
DURATA DELLA CORSA = fermare la corsa quando il blu di
bromofenolo raggiunge il bordo del gel
COLORAZIONE CON NITRATO D’ARGENTO
PREPARAZIONE DELLE SOLUZIONI (usare acqua distillata)
500 ml di Etanolo 10%
500 ml HNO3 1% (attenzione: preparare sotto cappa)
500 ml AgNO3 12 mM
500 ml soluzione di Na2CO3 anidro 0,28 M + formalina tale da avere una
concentrazione finale pari allo 0,019%
500 ml Acido acetico 10% (attenzione: preparare sotto
cappa)
500 ml di Glicerolo al 5%
Indossare 2 paia di guanti e mettere gli occhiali protettivi
COLORAZIONE
Etanolo 10% =agitare per 5 min.
HNO3 1% = agitare per 2 min.
H2O distillata = agitare per 1 min.
AgNO3 12 mM = agitare per 20 min.
H2O distillata = agitare per 3 min.
Na2CO3 anidro 0,28 M + 0,019% formalina = lasciare in agitazione sino alla
comparsa delle bande.
Acido acetico 10% = agitare per 3 min.
Glicerolo 5% = agitare per 3 min.
Al termine della colorazione trasferire il gel su un foglio di carta" Whatman"
3MM e ricoprirlo con un foglio di cellophane
Il gel è ora pronto per essere essicato
COLORAZIONE DEL GEL CON NITRATO DI ARGENTO
Un modo più sensibile ma anche più laborioso e dispendioso di
visualizzare bande di DNA in gel di poliacrilamide, comporta la
colorazione del DNA con argento. Questo metodo si basa sulla
chimica usata nello sviluppo fotografico. Il gel è immerso in una
soluzione diluita di etanolo per fissare il DNA al gel. Quindi il gel viene
incubato con una soluzione acida di nitrato di argento, che reagisce
con i nucleotidi delle singole eliche di DNA: si forma un precipitato in
corrispondenza del DNA in seguito alla riduzione dell'argento ionico
alla forma metallica, per opera della formaldeide a pH alcalino (sodio
carbonato). Lo sviluppo viene fermato acidificando la soluzione con
acido acetico. In media il metodo è da 10 a 100 volte più sensibile
della colorazione con bromuro d'etidio