Misurazione e uso di anticorpi
Misurazione delle funzioni dei linfociti T
Misurazione e uso di Abs
• Saggio ELISA• ELISPOT• Cromatografia d’affinità• Western Blotting• Microscopia ad immunofluorescenza• Citometria a flusso
Citometria a flusso
• Cellule in sospensione
• passano in singola fila attraverso
• un volume illuminato dove esse
• riflettono/rifrattono la luce ed emettono fluorescenza
• che viene raccolta, filtrata e
• convertita ad un valore digitale
• che viene inviato al computer
Fluidica
Ottica
Elettronica
Basi della Citometria a Flusso
Etidio Bromuro
PE (ficoeritrina)
Acido cis-Parinarico
Texas Red
Coniugato PE-TR
Ioduro di Propidio
FITC (fluoresceina)
600 nm300 nm 500 nm 700 nm400 nm457350 514 610 632488Linee
Laser Comuni
Fluorocromi utilizzati più comunemente
Cella di Flusso
Iniettore
Segnale di Fluorescenza
Raggio laser focalizzato
Fluido dirivestimento
Linfocito
Monocito
Granulocito
Schema generale della camera di flussodi un citofluorimetro
Rilevamento dei parametri fisici
Filtro Dicroico/Specchio a 45 gradi
Luce Riflessa
Luce trasmessaSorgente luminosa
(Forward Angle Light Scatter, FALS)
Sensore per ilFALS
Laser
Linfocito
Monocito
Granulocito
Scatter frontale
• Quando viene utilizzata una sorgente laser, la quantità di luce “scatterata” nella direzione frontale (ovvero lungo lo stesso asse attraverso cui viaggia la luce laser) viene raccolta nel canale del forward scatter
• L’ intensità del forward scatter è proporzionale alla dimensione, forma ed omogeneità ottica delle cellule (o delle altre particelle analizzate)
(90 Degree Light Scatter)
Sensore FALS
Sensore per il 90°LS
LaserLinfocito
Monocito
Granulocito
Scatter laterale
• Quando si utilizza una sorgente laser, la quantità di luce “scatterata” lateralmente (perpendicolare all’asse attraverso cui viaggia la luce laser) viene raccolta nel canale del side oppure 90°scatter
• Anche l’ intensità del side scatter è proporzionale alla dimensione, forma ed omogeneità ottica delle cellule (o delle altre particelle analizzate)
• Il Forward Scatter tende ad essere più sensibile alle proprietà della superficie cellulare delle particelle del Side Scatter – può essere usato per distinguere cellule
vive da cellule morte
• Il Side Scatter tende ad essere più sensibie alle inclusioni presenti all’interno della cellula del forward scatter– può essere usato per distinguere cellule
granulate da cellule non-granulate
Esempio di analisi dei leucociti e “gating” elettronico
LINFOCITI
MONOCITI
GRANULOCITI
Nuclei di linfociti normali o apoptotici
Complex or Boolean Gating
With two overlapping regions, several options are available:
R1 R2
Region 1 and Region 2:
Boolean Gating
M1
M1
R2
93%
LPS 10 µg/ml
Un-treated
3%
Espressione di molecole CD86 (B7.2)
Bordetella Pertussis Bordetella Para-pertussis
B7.2
MHC II
CD 40
Cecilia 2 (exp. M) - 13 febbraio 2004 D1 : batteri = 1:75 spin 90 min. incubazione
FL1-H : CD11b
FL2-H : CD11c
DCCD11c+CD11b+pDC
CD11c+CD11b-
MacrophagesCD11c-CD11b+
T cellsCD11c-CD11b-
B cells
FL1-H
Analisi citofluorimetrica
FL
2-H
Analisi del ciclo cellulare
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apoptosi
analisi al citofluorimetro
singole
Il “sorting” cellulare
488 nm laser
+-
FACS:Fluorescence Activated Cell Sorting
Piastre caricheelettricamente
Cellule singole separate dentrodiverse provette
FALS Sensor
Fluorescence detector
ElectrodeCrystal
Laser
Amp. (v)
Freq. (Hz)
Jet-in-Air
Nozzle
OpticsElectronic
Amp. (v)
Freq. (Hz) Laser
Nozzle
Jet-in-Air
Electrode
Crystal
OpticsElectronic
Amp. (v)
Freq. (Hz) Laser
+/- 190 V
Fluorescence+++++++++
Nozzle
Delay Time
Break-off Point
Jet-in-Air
Electrode
Crystal
OpticsElectronic
- 3000 V + 3000 V
+
+
__
Jet-in-Air
Analisi pre-sorter
Macrofagi peritoneali CD11b positivi
Gating
Macrofagi peritoneali CD11b positivi
Sorted
CD11b HIGH sorted CD11b INT. sorted
Misurazione e uso di Abs
• Saggio ELISA• ELISPOT• Cromatografia d’affinità• Western Blotting• Microscopia ad immunofluorescenza• Citometria a flusso
• Legame diretto con l’Ag
• Sandwich
ELISA
ELISAsandwich
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ELISPOT
Western blotting
Cromatografia d’affinità
Magnetic sorting
miniMACS
Microscopia ad immunofluorescenza
.
.
.
.
.
.
Immuno Staining (anti-occludina)
polilisina/vetrinoconc. finale di Poli-L. 0,5 mg/ml, in H2O20 min. RT2 lavaggi con H2Oasciugare bene
PREPARZIONE DEI CAMPIONISeminare 1,5 x 105 cells/vetrino, in 70 µl di terreno NO sieroIncubazione, 15 min 37 ー C (incubatore)Controllare al microscopio
FISSARE LE CELLSAspirare il surnatanteAggiungere 70 µl di PFA1%, 60 min a 4 ー CLavare tre volte con PBS 1X (RT)A questo passaggio posso conservare i campioni (in PBS, 4 ー C)
1
COLORAZIONE
Aspirare il PBSPermeare, 0,05%TRITON X-100 in PBS, 5 min on ice.Washing 3X con PBSBlocking con 3%BSA in PBS, 15 min RTWashing 3x con PBS
Primary Ab, anti-occludina (rabbit, 1 mg/ml, ZYMED, cat. N. 71.1500), usare 10 µg/ml finale in BSA 0,5% in PBS. Centrifugare 3 min a 3000 rpm. 70 µl/vetrino1 h on iceWashing 3x con PBS
Secondary Ab, a-rabbit, IgG, Cy3-conjugated (donkey Jackson Cod. n. 711.166.152). Suggested dilution 1:700, in BSA 0,5% in PBS. Centrifugare 3 min a 3000 rpm. 70 µl/vetrino.30 min on ice, al buio.Washing 3x con PBSMontare il vetrino (coverslip) su portaoggetti usando 5-6 µl di moviol30 min RT, buioVetrino a – 20 ー C.
2
Misurazione delle funzioni dei linfociti T
A differenza della misurazione della risposta anticorpale umorale, l’immunità mediata dalle cells T è tecnicamente più difficile da misurare.
Le cells T non secernono prodotti in grado di legare l’antigene, per cui non esiste per questo tipo di risposta nessun semplice saggio di legame
Studio di funzioni linfocitarie
Le funzioni del linfociti T possono essere misurate in 3 modi:
1. Uccisione del bersaglio cellulare
2. Attivazione delle cellule APC
3. Produzione di citochine
Metodiche
1. saggio di citotossicità
2. saggio di proliferazione
3. misurazione di citochine
Attività citotossica:Rilascio di cromo da cellule bersaglio
Proliferazione antigene-specifica dellecellule T
Misura citochine prodotte:intracellular staining
Intracellular staining
1- cellule in piastra a concentrazione molto alta (5x105cells/ml)
2- aggiungere Brefaldine (BFA) 10 µg/ml
3- raccogliere le cellule e suddividerle nei tubi (1-1,5x106cells/ml/sample)
4- blocking: incubare 100 l di PBS-FCS 5% 10 min RT
5- aggiungere anticorpo di superficie
6- lavare 4 volte con 2 ml PBS-FCS 5%
7- fissare con 500 l/tubo di paraformaldeide 2% e incubare 10 minuti RT
8- lavare con 2 ml di PBS-FCS 5%
9- permeare: risospendere le cells in 500 l PB (PBS+FCS 5%+0.5% saponina). 10 min RT
10- aggiungere 1 ml PB e centrifugare 1200 rpm x 5 min
11- risospendere in 100 l di PB+siero per blocking (1:25)
12- aggiungere anticorpo intracellulare
13- incubare 30 min RT al buio
14- lavare 2 volte con PB
15- lavare 2 volte con PBS-FCS 5%
Misura citochine prodotte:cytokine capture
CFSE is cell membrane permeable and readily accumulates inside of viable cells where it covalently attaches to intracellular proteins. Hydrolyzed CFSE emits fluorescence and covalently-attached fluorescein molecules seldom leak from cells. CFSE-labeled cells can be monitored over several weeks in vivo. Therefore, CFSE is utilized for viable cell detection as well as for the long-term observation of cell activities by fluorescent microscopy. The excitation and emission wavelengths of CFSE-labeled cells are 500 nm and 520 nm, respectively.
5- or 6-(N-Succiimidyloxycarbonyl)-3',6'-O,O'-diacethylfluorescein
CFSE
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T cell proliferationCFSE staining
WT IL-2-/-No DCs
CD8C
FS
E
48 h
72 h
FSC
Allogeneic CD8 T cell proliferation