corso di laurea specialistica magistrale Biotecnologia
aula 6a ore 14.00-16.00
corso di genomicaa.a. 2009/10
lezione 15 Dicembre Programmi informatici per confronti genomici. Dr.P. D’addabbo
lezione 23-24 venerdì 11 Dicembre 2009
verso l’epigeneticametodi di analisi genomica
cercare sul genoma le funzioni
cercare i meccanismi che attivano le funzioni
cercare le strutture che attivano i meccanismi per esprimere le diverse funzioni
cercare come variano le strutture che attivano i meccanismi per esprimere le diverse funzioni
regolazione è una definizione troppo generica?chi è che regola i regolatori? il sistema è ciclico
dagli enhancers alle Regulatory Regions
complessi regolativi = strutture che contengono più enhancers ma anche gli insulators e modulators (inibitori)
effetto sinergico : più facile da stabilire perchè funziona su geni reporter anche su cellule in vitro
abbiamo visto che le RR o enhancer complex possono distare fino a megabasi dai geni che controllano
come si possono studiare?
come sono regolate?
regolazione dei regolatori
regolazione trans e regolazione cis
il terzo livello è quello della regolazione epigenetica
ma anche questa può essere cis regolata e trans regolata
la regolazione cis funziona tramite regioni di DNA a cui si legano complessi proteici e permettono il rimodellamento della cromatina con l’avvicinamento del complesso al promotore
la regolazione trans funziona tramite proteine che interagiscono ad uno dei tanti possibili livelli direttamente o indirettamente
il livello epigeneticoil livello epigenetico è quello che precede la fase in cui si attivano le regioni regolative
però essendo anch’esso un sistema a base enzimatica funziona con una regolazione analoga alle altre, ma che produce effetti sulla cromatina e sul suo funzionamento
come già abbiamo detto in un sistema circolare in cui la cellula riceve stimoli dall’esterno e li trasmette all’interno e viceversa
- difficile definire quale sia il livello superiore- sicuramente esiste un presente ed un poi - si tratta di vedere quele è il punto presente e da quello
discendono gli altri ma solo temporalmente
una Regione Regolativa
deve avere dei confini “boundaries” “insulators” (CTCF)
e poi ha le regioni interne con gli enhancers (DNAse I)
al momento attuale si conoscono gli enhancers con i siti di consensus per i fattori di trascrizione
esistono altre informazioni sui siti di metilazione (epigenetici)
si potrebbero individuare i siti di binding o di avvolgimento ai nucleosomi
dal DNAse assay
per individuare una regione con possibile attività di enhancersi incomincia a fare i test di sensibilità alla DNAse I
si stabilisce un pattern della regione : una mappa
strategia DNAse I assay
throughput analysis of DNAseHistorically, the simplest method to robustly identify active gene regulatory elements has been enzymatic digestion of nuclear DNA by nucleases such as DNaseI. Regions of extreme chromatin accessibility to DNaseI, commonly known as DNaseI hypersensitive sites, have been repeatedly shown to be markers for all types of active cis-acting regulatory elements, including promoters, enhancers, silencers, insulators, and locus control regions. However, the original classical method, which for over 25 years relied on Southern blot, was limited to studying only small regions of the genome. Here we describe the detailed protocol for DNase-chip, a high-throughput method that allows for a targeted or genome-wide identification of cis-acting gene regulatory elements.Methods Mol Biol. 2009;556:177-90. Mapping regulatory elements by DNaseI hypersensitivity chip (DNase-Chip). Shibata Y, Crawford GE.
le RR inserite in un contesto
il contesto in cui stanno inserite è tutto da scoprire
è tanto se si sa che svolgono il ruolo di regione regolativa
il meccanismo di azione si comprende tramite analisi 3D
la tridimensionalità dinamica spazio/temporale
metodi ChIP e fluorescenza microscopi confocali
un esempio : la 3’RR delle IgH
la regolazione delle immunoglobuline
contemporaneità della maturazione del linfocita B e delle immunoglobuline
le immunoglobuline sono costituite da una catena pesante ed una leggera e la produzione deve essere coordinata
la produzione è regolata nelle cellule della memoria dopo lo switch isotipico e poi riattivata quando sono stimolate
all’esterno i linfociti B partecipano con i T e tutti gli altri alla risposta immunitaria umorale / cellulo mediataquindi la regolazione deve tenere conto di tutte queste interazioni
la struttura della RR della catena pesante
studiata nel topo e ritrovata nell’uomo e in tutti i mammiferi è altamente conservata
i meccanismi della sincronizzazione non sono ancora noti
è supposto che la soluzione stia nella compartimentazione nucleare
ritorna l’ipotesi dell’
Locus catena leggera
Locus catena leggera
Locus catena pesante
Cromosoma 22
Cromosoma 2
Cromosoma 14
LOCI DELLE CATENE PESANTI E LEGGERE DELL’Ig
mappe dei loci IgH e IgL
attivazione selettiva e coordinata dei fenomeni maturativi (i siti di attacco alla matrice nucleare, colocalizzazione ?)
TOR VERGATAU
Mouse Igh cluster Chromosome 12
Human Igh cluster Chromosome 14
12F1
14q32.33
mta1
mta1JDV
JDV
mta1 crip2 crip1 hole
mta1 crip2 crip1 hole
a b
J D V
J D V
elk 2.1 hs4 hs1.2 hs3 20bp 1
3’1
hole elk 2.2 hs4 hs1.2 hs320bp 2
3’2
hs 4
hs 3
Bhs
1,2
hs 3
A
hs 4
hs 1
,2hs
3
hs 4
hs 1
,2hs
3
3’2 3’1
BAC199M11(AF450245)
86,035,000 86,040,000 86,045,000 86,050,000 86,055,000 86,065,000 86,070,000 86,075,00086,060,000
85,894,500 85,904,500 85,914,500 85,924,500 85,934,500 85,944,500 85,954,500
centromero telomero
trascrizione
IgH3’RR-1
IgH3’RR-2
(cloni instabili)
cluster Ig topo-uomo (duplicazione)
TOR VERGATA
Chromosome 14
IgH3’RR-2SF AL928742 (40 kb)
H
2
B
HS3
B
U2 U4
U5
B
R3
H
HS1,2
E
R3r U5rU1
R1
U3 U6 U7
U8r
B
U6r
HS4
Ub1 U4-5
R3 U7r
Ub2
B H
R4U9
R5
Ub3
U10
R5
U11
U12
R6
SA2.5 A2R A2F
Alu
U15 U16
H
LTR
END OF HOMOLOGY WITH ALFA1
U14U13
Ub4
H
1
B
HS3
B
U2U4
U5
B
R3
H*
HS1,2
E
R3r U5r
U1R1
Ua1
R2
U3
U6 U7 U8
B
U6r
HS4
B H
Ua2
R4
Ua3
U9 Ua4
R5U10
U11
R5
U12
R6
U13
SA2.5 A2R
Alu
U15 U16
H
LTR
END OF HOMOLOGY WITH ALFA2
K10 retrovirus
ELK2
H
U14
Ua5
A
B
centromero 3 1 2 41 2
clone CHR77 (35.616 kb)
Poly A site
Poly A site
IgH3’RR-1
TOR VERGATA
LCR locus control region (nel topo 4 enhancers)IgH3’RR-1/-2 (nell’uomo 3 enhancers/locus)
V D J
human chromosome 14 q 32
HS3A HS1,2A HS4A HS3B HS1,2B HS4B
3 1 2 41 a2 centromero
duplicazione 1 duplicazione 2
mouse Ig heavy locus*HS3A HS1,2 HS3B HS4 +5,6,7
L C R a b
LCR*HS = hyper sensitivity to DNase I
3’RR-1 3’RR-2
TOR VERGATA
transcriptionE
E
cosa ci dicono i confronti genomici
confronti nelle specie delle varie strutture conservate
-analisi della conservazione e variazione interspecifica-analisi della variabilità intraspecifica (polimorfismi)
-individuazione delle regioni rilevanti
-metodi di analisi dei confronti genomici (lezione 15 Dic)
-ipotesi sui meccanismi
quali studi sono stati fatti sulle 3’RR IgH
gli enhancers funzionano come un complesso?
il sistema è ridondante e le funzioni possono sopperire e sostituirsi alle altre per mantenere il sistema funzionante
per questo ci possono essere risultati discordanti tramite la disattivazione o delezione di parti del complesso
a volte dei topi transgenici per la mancanza di un enhancer non hanno dato fenotipo
HS fragments are able to synergize with Vk,VH,IgH germline promoters (2b, 3, ,) and non Ig-prmoters (c-myc) so as to enhance the transcription activity in a tissue
and stage specific manner. (Ong et al, 1998)
Symergic effects
TOR VERGATA synergism of HS3A-B-HS1,2-HS4
se nell’uomo ci sono due 3’RR ci sarà un motivo ?
3 domande + 1: è cambiato il sistema di regolazione rispetto al topo ?nell’uomo si possono studiare i polimorfismi (i topi di campagna si allevano male)- dalle diverse forme alleliche si può capire il funzionamento delle due 3’RR ? - hanno tempi di attivazione diversi?
perchè due 3’RR ? sono ridondanti ?
- si attivano e disattivano in fasi diverse della vita del linfocita B?
TOR VERGATAU
