LEZIONE 8Ingegneria cellulare

CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA 2010-11

Adriana Maggi

Ingegneria Cellulare

Modificazione del genoma di cellule in coltura mediante mutazioni del genoma stesso o

integrazione di DNA esogeno

Finalità dell’ingegneria cellulare applicate alla farmacologia

•Identificazione di bersagli di farmaci

•Screening di farmaci

•Produzione di proteine terapeutiche

•Terapia cellulare

Ingegneria cellulare

considerazioni preliminari

1. Gene/processo di interesse

2. Tipo di cellula da transfettare

3. Scelta del vettore

4. Modalità di transfezione/infezione

5. Applicazioni

La scelta del sistema cellulare 1.

• coltura primaria

• cellula immortalizzata

• linea tumorale

Scelta del sistema cellulare 2.

2. Efficienza di transfezione

3. Modificazioni post-traduzionali

4. Espressione di fattori di regolazione dell’espressione genica

5. Facilità di analisi immunologica o di purificazione della proteina (espressione di proteine omologhe)

1. Facilità di coltura e stabilità

Scelta del vettore per ingegneria cellulare

1. La scelta del vettore

Determinata dal tipo di sistema che si vuole generare:

1. iperespressione proteica

2. espressione regolata per studio della funzione del gene, per produzione limitata nel tempo

3. studio della regolazione della espressione di un gene

Vettori per ingegneria cellulare

sequenze per la replicazione in procariote

Cassetta di espressione

Polylinker Promotore (virale, tess. specifico,inducibile ,

ecc.)

Modificazioni posttrascrizionali (Siti di: terminazione della trascrizione; poliadenilazione;

segnali di splicing )

Marcatori di selezione

Vettori di espressione: il vettore pCI-neo Promotore virale

Introne chimerico

Polylinker

Poliadenilazione

Promotore T7 pol

Promotore T3 pol

Origine di replicazione del fago f1

Neo resistenzaPromotore virale

Poliadenilazione

Amp resistenza

E.Coli ori

T-antigen e cellule COS.

L’uso di cellule COS consente di ottenere alti livelli di

espressione di proteine esogene senza l’utilizzo di promotori

virali forti. Il gene è clonato in un plasmide che include l’origine di replicazione virale di SV40. Le cellule Cos contengono, nel loro

genoma, il gene codificante per il T-antigen, una proteina che

riconosce l’origine di replicazione di SV40 e stimola una massiccia replicazione del

plasmide.

Promotori inducibili: il sistema Tet-on/Tet-off

Utilizzando il sistema di regolazione trascrizionale dell’operone responsabile della tetraciclina-resistenza di E. Coli è possibile regolare l’espressione di un transgene.

Il sistema è composto da un transattivatore chimerico che lega tet-responsive-element TRE espresso in modo costitutivo (promotore virale o tessuto-specifico)

Il gene la cui trascrizione deve venire regolata è sotto il controllo di un promotore contenente TRE

E’ necessario cotransfettare un plasmide contenente il fattore di regolazione ed un plasmide contenente il

transgene sotto il controllo trascrizionale di un promotore responsivo alla tetraciclina.

Il sistema Tet-on/Tet-off

pCMV tetR VP16 Tet-OFF

pCMV rtetR VP16 Tet-ON

TRE Pmin CV Gene of interest

Transcription

Plasmidi codificanti

per l’elemento di regolazione

Plasmide contenente il transgene

Il sistema Tet-off basato sulla produzione della proteina transattivante tTA

è represso in presenza di tetraciclina o dell’analogo doxiciclina

Il sistema Tet-On basato sulla produzione della proteina transattivante rtTA

è indotto in presenza di tetraciclina o dell’analogo doxiciclina

Integrazione di DNA esogeno nel genoma cellulare

Gene trapping ( integrazione casuale)

Gene targeting (integrazione sito-specifica)

La ricombinazione omologa è il processo alla base della integrazione sito specifica

Es. di gene targeting

GENE knock-out; GENE Knock-in

Integrazione random

Integrazione sito specifica

Gene targeting vector

DNA target

C9H13N5O4 peso molecolare: 255.23

Ganciclovir, un analogo di nucleosidi che puo’ essere fosforilato ad un tripfosfato analogo da parte dell’enzima timidina cinasi di

Herpes simplex e quindi integrato nel DNA.

Mutanti tk- non sopravvivono in terreno HAT (Aminopterina) se la via di salvataggio non è

praticabile

Timidino chinasi

Nucleotidi: Biosintesi ex novo o “salvataggio”

L’enzima tk è necessario alla via di salvataggio

5-fosforibosil-1-pirofosfato

Uridina monofostato

Inosina monofostat

o

Timidina monofostato

AMINOPTERINA

Guanina monofostato

Adenina monofostato

IpoxantinaTimidina

3. Modalità di trasfezione

Transfezione transiente o stabile

Tecnologia per la transfezione

Transfezioni stabili o transienti

Transfezioni transienti: il gene esogeno entra nel nucleo e viene trascritto dalla RNA pol II ma non si

integra nel genoma della cellula transfettata. Viene perduto dopo pochi cicli replicativi

Transfezioni stabili: il gene esogeno viene integrato nel genoma della cellula ed in presenza

di una adeguata pressione selettiva viene mantenuto per numerosi passaggi in coltura.

La probabilità di integrazione stabile è dell’ordine di 10-4, 10-6 sul totale delle

cellule transfettate

Transfezione stabile

Durante le prime 48 ore dopo la transfezione, fino al 50% delle

cellule contengono il DNA esogeno. In seguito, a causa della degradazione e della diluizione, le

cellule che non hanno integrato tale DNA nel loro genoma lo

perdono. Per isolare le cellule transfettate stabilmente occorre applicare una pressione selettiva, utilizzando un apposito marker di

selezione.

Marcatori di selezione per cellule di mammifero

Tk fosforila la timidina

Aminopterina (Inibisce sintesi

timidina-P)

Timidina chinasi (Tk)

XGPRT sintetizza GMPAcido micofenolico(Inibisce sintesi GMP)

Xantina-guanina fosforibosil

transferasi (XGPRT)

Inattiva Xyl-A9--D-furanosil (Xyl-A) (danneggia

DNA)

Adenosina deaminasi (ADA)

HPH inattiva igromicina

Igromicina B (Inibitore sintesi proteica)

Igromicina fosfotransferasi (HPH)

Variante resistente DHFR

Metotrexate (Inibisce DHFR)

Diidrofolato reduttasi (DHFR)

APH inattiva G418G418 (Inibitore sintesi proteica)

Aminoglicoside fosfotransferasi (APH)

MECCANISMOFARMACOENZIMA

Transfezione stabile - applicazioni

Generazione di linee cellulari con caratteristiche specifiche per la produzione di

biofarmaci o lo screening di molecole farmacologicamente attive.

Servono markers specifici per poter selezionare le cellule transfettate

Transfezione transiente - applicazione

Studio della regolazione dell’espressione genica con sistemi reporter

Studio dei meccanismi di trasduzione del segnale

Identificazione di molecole attive su enzimi o recettori

Studi di correlazione struttura attività di mutanti